Analýza Nse1-Nse3-Nse4 podjednotek SMC5-6 komplexu

Mgr. Tereza Frostová

Master's thesis

Analysis of the Nse1-Nse3-Nse4 subunits of the SMC5-6 complex

Abstract:

SMC (Structural Maintenance Chromosomes) komplexy jsou vysoce konzervované proteiny, které se nacházejí u většiny eukaryot od kvasinek po savčí buňky. Mezi SMC proteiny patří kohezin skládající se z podjednotek Smc1 a Smc3, kondenzin tvořený z podjednotek Smc2 a Smc4 a SMC5-6 komplex. Kohezin je buňkou využíván pro správné rozdělení sesterských chromatid v mitóze a při opravě dvouřetězcových zlomů. Kondenzin zajišťuje zahuštění chromatinového vlákna do mitotických forem chromozomů. SMC5-6 komplex se podílí na opravě dvouřetězcových zlomů, stabilizaci replikační vidlice a udržování kontrolního bodu v S-fázi. Ačkoliv je SMC5-6 komplex pro buňku nepostradatelný, dosud nebyla jeho funkce ani struktura dostatečně popsána. Součástí lidského SMC5-6 komplexu jsou podjednotky NSE2 (non-SMC element 2) a trimer NSE1-NSE3-NSE4b. U Schizosaccharomyces pombe bylo zjištěno, že se tento trimer váže na DNA prostřednictvím podjednotky Nse3. Z lidských podjednotek byl zatím úspěšně purifikován dimer NSE1-NSE3 a byla prokázána jeho vazba na DNA prostřednictvím podjednotky NSE3. Cílem mé diplomové práce bylo purifikovat lidský trimer NSE1-NSE3-NSE4b a stanovit jeho DNA-vazebné vlastnosti. Vzhledem k nízké stabilitě podjednotky NSE4b během purifikace trimeru bylo nejdříve nutné optimalizovat délku NSE4b a purifikační protokol. Pomocí IMAC a strep-tactinové afinitní chromatografie byl izolován stabilní trimer NSE1-NSE3-NSE4b se zkrácenou délkou podjednotky NSE4b(33-199). Při následném testování DNA vazebných vlastností metodou EMSA bylo zjištěno, že NSE1-NSE3-NSE4b(33-199) trimer má podobnou afinitu k DNA jako samotný dimer NSE1-NSE3. Tento výsledek naznačuje, že NSE4b(33-199) fragment nepřispívá k DNA-vazebné afinitě SMC5-6 komplexu.

Abstract:

SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) complexes are highly conserved proteins that are found in most eukaryotes from yeast to mammalian cells. SMC complexes include cohesin consisting of subunits SMC1 and SMC3, condenzin composed of subunits Smc2 and Smc4 and SMC5-6 complex. Cohesin is used by cell for proper segregation of sister chromatids in mitosis and the repair of DNA double strand breaks. Condensin is used for condensation of chromatin fibers to form mitotic chromosomes. SMC5-6 complex is involved in the repair of DNA double strand breaks, stabilization of replication fork and maintenance of S-phase checkpoint. Although SMC5-6 complex is essential for the cell viability its structure and function is not well understood. Human SMC5-6 complex is composed of NSE2 (non-SMC element 2) and NSE1-NSE3-NSE4b trimer. For Schizosaccharomyces pombe, it was found that the trimer binds to DNA through Nse3 subunit. So far only human NSE1-NSE3 dimer was successfully purified and its binding to DNA was confirmed. The aim of my thesis was to purify human trimer NSE1-NSE3-NSE4b and determine its DNA-binding properties. Due to the low stability of the subunit NSE4b during purification of trimer it was first necessary to optimize purification of the NSE4b. Using IMAC and strep- tactin affinity chromatography I purified stable NSE1-NSE3-NSE4b trimer containing NSE4b(33-199) fragment. During subsequent analysis of DNA binding properties by EMSA it was revealed that the NSE1-NSE3-NSE4b(33-199) complex DNA-binding affinity is comparable to NSE1-NSE3 dimer. This result suggests that the NSE4b(33-199) fragment does not significantly contribute to the DNA-binding afinity of the SMC5-6 complex.

Keywords

SMC komplexy, SMC5-6, afinitní chromatografie NSE1-NSE3-NSE4b, DNA-proteinová vazba, MAGE (melanoma-associated antigen) proteiny, EID (E1A-like inhibitor of differentiation) proteiny.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 1. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 4. 2. 2014
• Supervisor: doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics