Příprava proteinových vzorků a jejich charakterizace hmotnostní spektrometrií

Mgr. Karel Stejskal, Ph.D.

Doctoral thesis

Preparation of protein samples and their characterization by mass spectrometry

Abstract:

Abstrakt I přes obrovský rozmach v hmotnostně spektrometrické instrumentaci v posledních letech, příprava vzorku stále zůstává klíčovým krokem v celém proteomickém experimentu. První část předkládané práce byla zaměřena na studium ztrát peptidového vzorku při jeho skladování v autosamplerové vialce před vlastní analýzou pomocí systému LC-MS/MS. Byl testován vliv šesti různých roztoků a sedmi typů komerčně dostupných autosamplerových vialek z rozdílných materiálů. Nejnižších ztrát bylo dosaženo při použití roztoku 0,001% polyetylenglykolu 20000 v 0,1% kyseliny mravenčí pro nastříknutí peptidového vzorku. Přidání roztoku PEG do autosamplerové vialky s peptidovým vzorkem potlačilo kvalitativní i kvantitativní ztráty především hydrofobních peptidů zejména po dvoudenním skladování vzorku ve vialce. Druhá část práce byla zaměřena na identifikaci post-translačních modifikací proteinu MAGEA1 a jeho interakčního partnera TRIM31. V práci byl využit navržený roztok pro potlačení sorpčních ztrát vzorku. Byla nalezena a funkčně ověřena dvě ubikvitinační místa na primární struktuře TRIM31, která jsou pravděpodobně výsledkem jeho auto-ubikvitinace aktivované při jeho interakci s proteinem MAGEA1.

Abstract:

Abstract Sample preparation is still a crucial step in proteomics experiment despite huge improvements in mass spectrometry instrumentation during recent years. The first part of my thesis was focused on a study of peptide sample losses during sample storage in autosampler vials before sample injection into LC-MS/MS system. Six sample injection solutions and seven commercial available autosampler vials from different material were tested. Solution of 0.001% polyethylen glycol 20000 in 0.1% formic acid provided the lowest losses. An addition of PEG solution into an autosampler vial with peptide sample suppresses qualitative and quantitative losses of mainly hydrophobic peptides even after 2 days storage in the vial. The second part of my theses was focused on identification of posttranslational modifications of MAGEA1 protein and its interaction partner TRIM31 protein. The suggested solution for suppression of peptide sample losses was used. Two ubiquitination sites were found and functionally evaluated in primary structure of TRIM31 which are probably results of auto-ubiquitination via its interaction with MAGEA1 protein.

Keywords

příprava vzorku, hmotnostní spektrometrie, adsorpce, kapalinová chromatografie, tandemová hmotnostní spektrometrie, ztráty vzorku, PEG, sample preparation, mass spectrometry, peptide adsorption, liquid chromatography, tandem mass spectrometry, sample losses

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 8. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 30. 9. 2015
• Supervisor: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
• Reader: prof. Ing. Lenka Hernychová, Ph.D., prof. RNDr. Karel Lemr, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Genomics and Proteomics