Kryokonzervace rybího spermatu: kvalita versus kvantita

Anatolii SOTNIKOV

Doctoral thesis

Fish sperm cryopreservation: the quality versus quantity

Abstract:

Sperm cryopreservation is considered a well-developed technology with a big potential for expanding the effectiveness of conservation programs preserving genetic diversity in endangered and economically important fishes. Fish sperm cryopreservation has developed over the years, and numerous approaches have been explored. Nowadays, it is evident that sperm cryopreservation protocols vary essentially according to taxa-specific properties of fish sperm, and to make the application of cryopreserved sperm the most effective, these protocols should be oriented toward practical requests. Due to the basic properties of fish sperm as cryobiological objects, it is clear that the protocols providing the best outcomes are not always appropriate for fisheries practice when cryopreserved material volume and easy-to-use packaging become vital parameters for the practice. That is why developing a sperm cryopreservation protocol suitable for fisheries practice in common carp is one of the primary goals of the current thesis. This goal was accomplished by developing a specific, aquaculture-oriented method for carp sperm cryopreservation. The second goal was to determine the optimal species-specific conditions for cryopreservation sperm in sturgeon possessing different ploidy levels. This goal was set because, specific to sturgeons, differences in sperm size associated with ploidy level could influence the optimal sperm concentration at cryopreservation. This aspect could be crucial for applying sturgeon sperm cryopreservation in fisheries practice and conservation programs. The third goal was set based on the necessity of a basic understanding of sperm sorting after unfreezing, which could help to reveal sperm cryopreservation damages in future studies and to avoid the negative effect of sperm cryopreservation on offspring performance. The thesis contains the following chapters. The first chapter represents an introduction to the problem. The second chapter of this thesis discusses that high spermatozoa concentration during cryopreservation decreases thawed samples' motility. Nevertheless, even with decreased motility, the cryopreservation of highly concentrated sperm samples reduces storage space in cryobanks and the volume of samples needed for artificial fertilization trials. The third chapter of this thesis shows that using 4.5 ml cryotubes in combination with specific cryomedium, freezing, and thawing rates gives an appropriate for fisheries practice method for cryopreservation of concentrated common carp sperm. Chapter four of this thesis showed that differences in spermatozoa sizes of different sturgeon species are not solely connected with ploidy level. Moreover, ploidy level is not a determinant of optimal sperm concentration for sperm cryopreservation in investigated species, and therefore, different sturgeon species are characterized by quite similar optimal sperm concentration at freezing and could be frozen by a similar cryopreservation approach. Chapter five describes the applicability of two sperm fractionation techniques for cryopreserved sperm in taxonomically distant fishes. Using Percoll gradient separation allows the separation of the sperm population with a significantly increased percentage of motile cells in common carp, sturgeons, and rainbow trouts. The use of microfluidic acoustic sperm separation was appropriate for sterlet, Siberian sturgeon, and rainbow trout but was ineffective for common carp. Importantly, both of these methods improve the quality of offspring obtained from cryopreserved sperm in terms of the percentage of abnormally developing larvae.

Abstract:

Kryokonzervaci spermatu ryb můžeme považovat za slibně se vyvíjející technologii s velkým potenciálem pro rozšíření účinnosti programů zachování genetické rozmanitosti u ohrožených a ekonomicky významných ryb. Kryokonzervace spermatu ryb se vyvíjela v průběhu let a byla zkoušena řada přístupů. Dnes je zřejmé, že se protokoly kryokonzervace spermatu podstatně liší podle taxonu a specifických vlastností spermatu ryb. A aby byla aplikace kryokonzervovaného spermatu co nejúčinnější, měly by použité protokoly zohlednit i praktické aspekty. S ohledem k základním vlastnostem spermatu ryb jako kryobiologických objektů je zřejmé, že protokoly poskytující nejlepší výsledky nejsou vždy vhodné pro rybářskou praxi, kdy se objem a forma jednotlivých dávek kryokonzervovaného materiálu, stejně tak jako snadná manipulace s dávkami, stávají klíčovými parametry pro praxi. Proto bylo jedním z cílů této práce vyvinout spolehlivý protokol kryokonzervace spermatu kapra obecného vhodný pro rybářskou praxi. Tento cíl byl dosažen vyvinutím specifické metody orientované na akvakulturu pro kryokonzervaci spermatu kapra. Druhým cílem bylo určit optimální, druhově specifické podmínky kryokonzervace spermatu jeseterů s různými ploidními úrovněmi. Tento cíl byl zvolen proto, protože druhově specifické rozdíly ve velikosti spermií spojené s ploidní úrovní by mohly mít vliv např. na optimální koncentraci spermatu při kryokonzervaci. Tento aspekt by mohl být klíčový pro použití kryokonzervace spermatu jeseterů v rybářské praxi a pro programy uchování genofondu. Třetím cílem bylo ověřit možnost třídění spermií v rozmrazeném spermatu jako nástroje k odhalení a k eliminaci kryokonzervací poškozených spermií a tím v budoucnu zabránit negativnímu účinku kryokonzervace spermatu na potomstvo. Práce obsahuje následující kapitoly. První kapitola představuje úvod do problému. Druhá kapitola této práce diskutuje vhodnou koncentraci spermií a skutečnost, že při vysokých koncentracích spermií během kryokonzervace dosahujeme nišší pohyblivosti spermií v rozmražených vzorcích. I přes nižší dosahovanou pohyblivost snižuje kryokonzervace vysoce koncentrovaných vzorků spermatu potřebu skladovacího prostoru v kryobankách a objem vzorků potřebných pro pokusy o umělé oplodnění. Třetí kapitola této práce ukazuje, že použití 4,5 ml kryozkumavek ve spojení s konkrétním kryomédiem, rychlostmi zmrazování a rozmrazování poskytuje vhodnou metodu pro kryokonzervaci koncentrovaného spermatu kapra obecného, vhodnou pro rybářskou praxi. Čtvrtá kapitola této práce ukázala, že rozdíly ve velikostech spermií různých druhů jeseterů nejsou spojeny pouze s ploidní úrovní. Navíc ploidní úroveň není určujícím faktorem optimální koncentrace spermatu pro kryokonzervaci u zkoumaných druhů, a proto se různé druhy jeseterů vyznačují poměrně podobnou optimální koncentrací spermatu při zmrazení a mohou být zmrazeny podobným postupem kryokonzervace. Pátá kapitola popisuje použitelnost dvou technik frakcionace spermatu pro kryokonzervované sperma u taxonomicky vzdálených druhů ryb. Použití separace pomocí Percoll gradientu umožňuje oddělení populace spermatu s významně zvýšeným procentem pohyblivých buněk u kapra obecného, jeseterů malého a sibiřského a pstruha duhového. Použití mikrofluidní akustické separace spermatu bylo vhodné pro jesetery malého a sibiřského a pro pstruha duhového, ale bylo neúčinné pro kapra obecného. Důležité je, že obě tyto metody zlepšují kvalitu potomstva získaného z kryokonzervovaného spermatu z hlediska procenta abnormálně se vyvíjejících larev.

Keywords

pohyblivost spermií, počítačově asistovaná analýza spermatu, kryokonzervace, Cypriniformes, Acipenseridae, umělá reprodukce

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 8. 2024

Thesis defence

• Supervisor: doc. MSc. Borys Dzyuba, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery