Analýza fytopatogenů pomocí hmotnostní spektrometrie

Mgr. Jana BEINHAUER

Disertační práce

Phytopathogen analysis using mass spectrometry

Anotace:

Mikroskopické houby patří mezi nejrozšířenější rostlinné patogeny působící značné ekonomické ztráty zemědělských plodin. Jedná se o eukaryotní organismy patřící zejména do říše hub (Fungi) a dalších samostatných říší (Protista, Chromista, Myxomycota). Tradiční přístupy identifikací jsou časově, manuálně a finančně náročné, je třeba zkušených fytopatologů a značné množství vzorku. Tato práce se zabývá identifikací a proteomickou analýzou fytopatogenů, zvláště obligátních biotrofních parazitů jako jsou peronospory (říše Chromista, řád Peronosporales), padlí (říše Fungi, řád Erysiphales) a rzi (říše Fungi, řád Pucciniales) pomocí hmotnostní spektrometrie (MS). Analýza představuje jak metody přímého získávání unikátních peptidových/proteinových profilů desorbovaných přímo z povrchu intaktních buněk či spor (IC/IS) pomocí laserové desorpce/ionizace za účasti matrice (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) ve spojení s analyzátory doby letu (time-of-flight, TOF), tak přístupy proteomické, kdy jsou proteiny extrahované ze spor blíže identifikované. Předchozí metoda vyvinutá pro identifikaci peronospor a padlí byla aplikována na další patogeny (rasy Bremia lactucae, Blumeria graminis, zástupce rodu Botrytis, rodu Puccinia). Anylýza zahrnuje použití směsi matric kyseliny ferulové (FA) a sinapové (SA) v poměru 5:15 mg?ml-1, v roztoku acetonitrilu (ACN) a 2,5% kyseliny trifluoroctové (TFA) v objemovém poměru 7:3 (v/v). Získaná hmotnostní spektra rozšiřují dosavadní databázi o nové unikátní peptidové/proteinové profily. Následně jsme zjistili, že alternativní přístupy analýzy získávání MS profilů patogenů představující 1) smývání spor přímo z listu roztokem matrice a 2) otisk povrchu listu na oboustrannou lepicí pásku nebo na MALDI destičku, jež byly aplikovány u listu rajčete napadeného O. neolycopersici, urychlují metodu získání typických signálů přímo z porvrchu listu, avšak skýtají jistá omezení, takže je nelze použít univerzálně na všechny patogeny. S cílem najít markery infekce B. lactucae a O. neolycopersici bylo pomocí několika proteomických přístupů identifikováno 156 respektive 90 proteinů extrahovaných do roztoku matrice (ACN/2,5%TFA, 7:3, v/v). Signály ve fingerprintových spektrech byly ztotožněny s 12 respektive 8 proteiny. Většina z nich představuje ribosomální proteiny. Protokol pro IC/IS MALDI MS rostlinných patogenů rodu Puccinia byl optimalizován na sporách P. triticina. Ty byly promývány v roztoku ACN/0.1% TFA (7:3, v/v), a suspendovány přímo ve směsi voda/roztok matrice (FA:SA, 5:15 mg?ml-1v ACN/2.5%TFA, 7:3, v/v) v objemovém poměru 1:1. Pro homogennější povrch kokrystalů spor s matricí byla vybrána technika dvou vrstev (2LV). Protokol byl aplikován i na další druhy rzí a jejich izoláty, které jsme schopni pomocí programu BIOSPEAN rozlišit. Podobně jako v předchozím případě, byla provedena extrakce proteinů ze spor P. graminis a P. striiformis. Analýza odhalila 40 a 30 proteinů, z nichž bylo možno tři proteiny od každé rzi přiřadit ke třem signálům ve spektru. Tyto výsledky představují metodu pro identifikaci a rozlišení rostlinných patogenů a jejich fyziologických ras pomocí MALDI-TOF MS, poprvé také u rzí. Přítomnost charakteristických proteinových markerů by v budoucnu mohla usnadnit určování a charakterizaci houbových rostlinných patogenů.

Abstract:

This work deals with the identification and proteomic analysis of phytopathogens, especially obligate biotrophic parasites such as downy mildews (Kingdom Chromista, order Peronosporales), powdery mildews (Kingdom Fungi, order Erysiphales) and rusts (Kingdom Fungi, order Pucciniales) using mass spectrometry (MS). Analysis represents both the method of direct acquisition of unique peptide / protein profiles of intact cells/spores (IC/IS) matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) in connection with time-of-flight analyzers (TOF) and proteomic approaches where detailed information about proteins extracted from spores is obtained. Following the previous work, the method developed for the identification of downy and powdery mildews was applied to other pathogens (Bremia lactucae races, Blumeria graminis races, representatives of Botrytis and Puccinia genus). This method comprising the use of MALDI matrix mixture containing ferulic acid (FA) and sinapinic (SA) in the ratio of 5:15 mg?ml-1in a solution of acetonitrile (ACN) and 2.5% trifluoroacetic acid (TFA) in a volume ratio of 7: 3 (v/v). The resulting mass spectra expand the database of unique peptide / protein profiles. Alternative approaches of MS analyses performed directly from plant material: 1) washing out the spores directly from the host leaf by matrix solution 2) imprinting the leaf surface on double-sided tape or directly on the MALDI plate were applied with a tomato leaf covered by O. neolycopersici spores. Although these alternative applications speedup method for obtaining the typical signals directly from leaf surface, they provide certain limitations. Thus we assumed that it cannot be applied universally to all pathogens. In order to find markers of infection from B. lactucae and O. neolycopersici spores several proteomic approaches were used and 156 respectively 90 proteins extracted in a solution matrix (ACN / 2.5% TFA, 7: 3, v / v) were identified. From them, 12 and 8 proteins were assigned to signals in fingerprint spectra, respectively. Most of them are represented by ribosomal proteins. Protocol for IC/IS MALDI MS analysis of Puccinia genus plant pathogens was optimized on spores of P. triticina. They were washed in a solution of ACN / 0.1% TFA (7: 3 v / v) and directly suspended in water / matrix solution (FA: SA 5:15 mg?ml-1in ACN / 2.5% TFA, 7: 3, v / v) in a volume ratio 1: 1. For more homogenous surface of matrix-spores cocrystals two layers (2LV) technique was chosen. The protocol was applied to other species of rust fungi and their isolates which is possible to differentiate using BIOSPEAN. Like in the previous case, proteins were extracted from spores of P. graminis and P. striiformis. Analysis revealed 40 and 30 proteins of which three proteins were assigned to three signals in the spectrum in both pathogens. These results represent a method for identification and discrimination of plant pathogens and their physiological races by MALDI-TOF MS, for the first time for analysis of rusts. The presence of characteristic protein markers could facilitate the identification and characterization of fungal plant pathogens.

Klíčová slova

fytopatogen, rzi, peronospora, padlí, optimalizace, identifikace, biotypizace, ISMS (hmotnostní spektrometrie intaktních spor), marker

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 10. 2015

Zveřejnit od: 29. 10. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie