Stanovení aktivity beta-sekretasy pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí

Bc. Tomáš Fuciman

Bachelor's thesis

Determination of beta-secretase activity using capillary electrophoretic method with fluorescence detection

Abstract:

Tato bakalářské práce se zaměřuje na zavedení metody pro separaci fluorescenčně značených složek reakční směsi beta-sekretasy, což je enzym, který se v mozkové tkáni spolupodílí na vytváření 42 až 43 aminokyselin dlouhých nerozpustných peptidů, označované jako beta-amyloidy. Podle obecně přijímané amyloidové teorie hrají tyto peptidy klíčovou roli v rozvoji Alzheimerovy choroby, závažného onemocnění vyznačujícího se především postupným poklesem kognitivních funkcí a mentálních dovedností, přičemž v poslední fázi vede až k smrti pacienta. V současné době lze pouze tlumit projevy nemoci. Lék, který by zpomalil nebo dokonce úplně zastavil progresi nemoci, zatím nebyl představen. Nalezení vhodného inhibitoru beta-sekretasy a potlačení její aktivity by tak mohlo představovat efektivní způsob léčby. Pro stanovení aktivity tohoto enzymu se v praxi využívá téměř výhradně metod založených na principu Fösterova rezonančního přenosu energie, avšak naměřené hodnoty stanovených parametrů jsou značně zkresleny především kvůli špatné rozpustnosti značeného substrátu a interferencím ovlivňujícím měřený signál. Částečné odstranění těchto nedostatků přináší námi zavedená metoda, založená na kapilární elektroforéze s využitím fluorescenční detekce. Tu lze díky minimální spotřebě vzorku a velice účinné separaci značeného produktu použít pro budoucí kinetické a inhibiční studie beta-sekretasy.

Abstract:

This bachelor‘s thesis is focused on development of a method based on capillary electrophoresis to determine kinetic parameters of beta-secretase, an enzyme that is involved in the production 42 or 43 amino acid long insoluble peptides called beta-amyloids in the brain tissue. According to generally accepted amyloid theory these peptides play a key role in the progression of Alzheimer's disease, which is characterized by a gradual decline in cognitive functions, mental abilities and memory and leads eventually to death. A drug that would reverse or stop the progression of the disease has not been introduced yet. Finding and application of a suitable inhibitor, which would decrease beta-secretase activity, could represent an effective treatment. In practice, the most commonly used methods for determining beta-secretase activity are based on the Föster's resonance energy transfer principle. However, these methods provide distorted results mainly due to poor solubility of a labeled substrate and non-specific interferences in a measured signal. The method presented in this work based on capillary electrophoresis with fluorescence detection constitutes a highly sensitive and efficient tool for kinetic and inhibition studies of beta-secretase. Furthermore it partly eliminates these drawbacks by separation of the labeled reaction product from the possibly interfering sample background.

Keywords

Alzheimerova choroba, beta-sekretasa, fluorescenční detekce, FRET, kapilární elektroforéza

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 12. 6. 2018
• Supervisor: Ing. Mgr. Roman Řemínek, Ph.D.
• Reader: Mgr. Jindra Smutná, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry