Vliv modifikace inkubačních podmínek na funkční parametry spermií býků v podmínkách in vitro

Bc. Michaela Dolanová

Diplomová práce

Influence of incubation conditions modification on functional parameters of bull spermatozoa in vitro

Anotace:

Reprodukční biotechnologie jsou v dnešní době hojně využívanými metodami, ať už se jedná o reprodukci zvířat či lidí. Se zvyšujícím se zájmem o tyto techniky souvisí i zdokonalování manipulačních postupů a poskytnutí co nejoptimálnějšího prostředí pohlavním buňkám, které jsou na jeho změny citlivé. Vhodné inkubační podmínky lze definovat jako prostředí s optimální teplotou, osmolalitou, stabilním pH a iontovým složením.Cílem této diplomové práce bylo vyhodnotit vliv změny inkubačních podmínek na býčí spermie in vitro. Během experimentů byly používány jak spermie po kryokonzervaci, tak nativní ejakulát, a to v případě zjišťování vlivu inkubačních podmínek na kapacitační status spermií. Spermie byly vystaveny dvěma odlišným inkubačním prostředím. První inkubační systém (ink. systém 1) spočíval ve standardní inkubaci spermií ve vodní lázni (38 °C). Druhým systémem (ink. systém 2) byla inkubace spermií v kapkách kultivačního média překrytých minerálním olejem (38 °C, 5 % CO2).Pro zjištění vlivu inkubačních podmínek na spermie byly hodnoceny funkční parametry v časových úsecích - 0 h a 1 h. Hodnocenými parametry byla motilita, viabilita, změna potenciálu mitochondriální membrány, akrozomální integrita a stupeň kapacitace spermií.U vzorků spermií po rozmrazení se vliv modifikace inkubačního prostředí na jejich funkční parametry projevil různě. Vzorky inkubované pomocí inkubačního systému 1 vykazovaly signifikantně vyšší (p < 0,05) celkovou procentuální motilitu: ink. systém 1 - 50,5 % (0 h), 47,1 % (1 h) vs. ink. systém 2 - 32,35 % (0 h), 32,09 % (1 h). Dále se signifikantně (p < 0,05) projevil vliv inkubačního prostředí na viabilitu spermií: ink. systém 1 - 30,57 % (0 h), 28,32 % (1 h) vs. ink. systém 2 - 24,36 % (0 h), 22,93 % (1 h). V případě dalších parametrů (akrozomální integrita, membránový potenciál mitochondrií) nebyl rozdíl signifikantní.V rámci hodnocení nativního ejakulátu vykazovaly vzorky inkubované pomocí inkubačního systému 1 signifikantně vyšší (p < 0,05) procento spermií s nízkým stupněm kapacitace (ink. systém 1 - 15,35 % vs. ink. systém 2 - 6,5 %). U ostatních kapacitačních stupňů (střední, vysoký) nebyl rozdíl signifikantní.Z výsledků je patrný vliv inkubačních podmínek na funkční parametry spermií, z čehož lze vyvodit možný negativní vliv oleje. Na druhou stranu u experimentů vedených pro zjištění míry kapacitace spermií je z předběžných výsledků vidět pozitivní vliv inkubace v médiu překrytým minerálním olejem.Na základě výsledků této práce lze říci, že použité inkubační podmínky hrají roli při udržení funkčních parametrů spermií po rozmrazení a do určité míry ovlivňují kapacitační stav spermií. Pro potvrzení tohoto je nutno provést další senzitivní analytická stanovení, která by ukázala, zda některé potencionálně negativně působící složky přechází z minerálního oleje do inkubačního média a vyhodnotit v tomto smyslu další typy minerálních olejů. U experimentů zaměřených na kapacitaci spermií je zapotřebí v budoucnu provést další například proteomické analýzy.

Abstract:

Nowadays, reproductive biotechnologies are frequently used methods in both animal and human reproduction. The increasing interest in these techniques leads to the improvement of handling processes and the development of the most optimal environment for gametes that are sensitive to its changes. Suitable incubation conditions can be defined as an environment with optimal temperature, osmolality, stable pH and ionic composition.The aim of this thesis was to evaluate the effect of a change of incubation conditions on bull spermatozoa in vitro. During the experiments, cryopreserved sperms were used for the determination of functional parameters and native ejaculate was used to determine the effect of incubation conditions on the capacitation status of spermatozoa. Spermatozoa were exposed to two different incubation environments. The first incubation system (inc. system 1) was incubation of the spermatozoa in a water bath (38 °C). The second system (inc. system 2) was incubation of spermatozoa in droplets of culture medium overlaid with mineral oil (38 °C, 5 % CO2).To determine the effect of incubation conditions on the sperms, the functional parameters were evaluated at 0 h and 1 h. The evaluated parameters were motility, viability, change in mitochondrial membrane potential, acrosomal integrity and the degree of sperm capacitation.For the samples of thawed sperms, the effect of modifications of the incubation environment had various impact on their functional parameters. Samples incubated with incubation system 1 showed significantly higher (p <0.05) total percent motility: inc. system 1 - 50.5 % (0 h), 47.1 % (1 h) vs. inc. system 2 - 32.35 % (0 h), 32.09 % (1 h). Furthermore, the effect of the incubation environment on sperm viability was significant (p <0.05): inc. system 1 - 30.57% (0 h), 28.32 % (1 h) vs. inc. system 2 - 24.36 % (0 h), 22.93 % (1 h). For other parameters (mitochondrial membrane potential, acrosomal integrity), the difference in environments was not significant.In the evaluation of native ejaculate, samples incubated with the incubation system 1 showed a significantly higher (p <0.05) percentage of sperms with a low degree of capacitation (inc. system 1 - 15.35 % vs. inc. system 2 - 6.5 %). For other capacitation levels (medium, high), the difference in environments was not significant.The results clearly show the influence of incubation conditions on the functional parameters of spermatozoa, from which a possible negative effect of mineral oil can be deduced. On the other hand, in the experiments, that were performed to measure sperm capacitation, the preliminary results show a positive effect of incubation in the medium overlaid with mineral oil.Based on the results of this thesis, can be said that the different incubation conditions have an impact on the functional parameters of thawed sperms and to a certain extent affect the capacitation state of spermatozoa. In order to confirm these results, additional sensitive analytical assays are needed to show whether any potentially negative acting component passes from the mineral oil to the incubation medium and other types of mineral oils have to be analyzed. In the case of experiments on sperm capacitation, more analyses are needed, e.g. proteomic analysis.

Klíčová slova

spermie, inkubační podmínky, in vitro

Keywords

spermatozoa, incubation conditions, in vitro

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Ondřej Šimoník, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie