Vývoj fluorescenčních substrátů pro enzymologické aplikace

Bc. Zuzana Korenčiaková

Bakalářská práce

Development of fluorescence substrates for enzymological applications

Anotace:

Enzymy jsou biopolymery katalyzující většinu metabolických procesů a komplexita vztahu jejich struktury a funkce je studována enzymologií. Avšak experimentální techniky tradiční enzymologie pracující s velkým ansámblem molekul nedokážou dostatečně detailně popsat dynamickou povahu a katalytický mechanismus enzymů. Na druhé straně, experimentální techniky na úrovni jedné molekuly včetně silové manipulace a fluorescenční spektroskopie jsou schopné studovat jednotlivé konformace enzymu a tranzitní stavy enzymových reakcí. Použití fluorescenčních substrátů cílových enzymů jako reportérů ve fluorescenční spektroskopii by umožnilo detailní výzkum bez modifikace studovaných biopolymerů. Tato bakalářská práce je zaměřena na hledání a charakterizaci fluoroforů, které by projevily spektrální změnu během enzymatické reakce s halogenalkandehalogenasami použitými jako modelový systém studie. Jejich aktivní místo je hluboce pohřbené uvnitř molekuly a spojené s okolím vstupními tunely, které existují ve více konformacích. S využitím virtuálního screeningu a následného experimentálního testování čtyř vybraných halogenovaných molekul na bázi kumarinu byl identifikován substrát, který poskytuje významnou změnu ve své fluorescenci během reakce katalyzované halogenalkandehalogenasou DmmA. První část bakalářské práce je věnovaná charakterizaci a využití fluorescenčního substrátu pro studium enzymatické reakce halogenalkandehalogenas. V druhé části bylo provedeno molekulové dokování vybraných organických fluoroforů za účelem hledání fluorescenčního substrátu využitelného ve spektroskopii na úrovni jedné molekuly.

Abstract:

Enzymes are biopolymers catalysing the majority of metabolic processes and complexity of their structure-function relationship is studied by enzymology. However, experimental techniques of traditional enzymology working with large ensemble of molecules cannot describe the dynamic nature and catalytic mechanism of enzymes in sufficient detail. In contrast, single molecule techniques, including force-based manipulation and fluorescence spectroscopy, have potential to study individual enzyme conformations and transient states of the enzymatic reaction. Use of fluorescent substrates of target enzymes as reporters in fluorescence spectroscopy would enable detailed investigation without any modification of the studied biopolymer. This Bachelor Thesis is focused on search and characterisation of fluorophores that would exhibit a spectral change upon enzymatic reaction with haloalkane dehalogenases (HLDs) used as a model system in this study. Their active site is deeply buried and connected to the surrounding environment by access tunnels that exist in multiple conformations. Virtual screening followed by experimental testing selected coumarin-based dyes revealed the first fluorescent substrate of HLDs, providing a change in its fluorescence during the reaction catalysed by DmmA dehalogenase. The first part of this Bachelor Thesis is dedicated to the characterisation of novel fluorescent substrate and its application in study of enzymatic reaction of HLDs. In the second part, molecular docking of chosen organic fluorophores was conducted in search for a fluorescent substrate applicable for single-molecule spectroscopy.

Keywords

enzymologie, enzymová kinetika, techniky na úrovni jedné molekuly, fluorescenční substráty, halogenalkandehalogenasy, molekulové dokování, enzymology, enzyme kinetics, single-molecule techniques, fluorescent substrates, haloalkane dehalogenases, molecular docking

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 5. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 6. 2015
• Vedoucí: prof. RNDr. Zbyněk Prokop, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Chemie / Biofyzikální chemie