Technologie přípravy a isolace rekombinantních proteinů: studium chemických vlastností vybraných mutant rekombinantní kukuřičné Beta-glukosidasy Zm-p60.1

Mgr. Pavel Klimeš, Ph.D.

Bachelor's thesis

Preparation and isolation of recombinant proteins: chemical properties of mutated recombinant Beta-glucosidase Zm-p60.1

Abstract:

Kukuřičná b-glukosidasa (EC 3.2.1.21) Zm-p60.1 je enzym katalyzující hydrolýzu trans-zeatin-O-glukosidu na glukosu a trans-zeatin. Tato práce řeší technologie přípravy a izolace rekombinantních proteinů a studia vlastností mutant SB1 a SB2 kukuřičné b-glukosidasy Zm-p60.1. Teoretickou část představuje literární rešerše věnovaná problematice purifikace rekombinantních proteinů zapojených do cytokininového metabolismu rostlin. Praktická část práce řeší produkci, purifikaci a enzymovou kinetiku mutant SB1 a SB2 kukuřičné b-glukosidasy Zm-p60.1. Obě mutanty byly exprimovány v Escherichia coli BL21(DE3)pLysS-T1R a purifikovány afinitní chromatografií na koloně HisTrap HP (5 ml) a gelovou filtrací za využití kolony HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. Čistota purifikovaných proteinů byla vyšší než 95 %. Enzymová kinetika byla měřena při 30 °C na umělém substrátu pNPG: u mutanty SB1 byly zjištěny hodnoty Km = 0,48 ± 0,02 mmol•l-1 a kcat = 12,94 ± 0,10 s-1; u mutanty SB2 byly hodnoty Km = 0,50 ± 0,02 mmol•l-1 a kcat = 19,12 ± 0,20 s-1. Hydrolytická eficience mutanty SB2 je asi o 30 % vyšší než u mutanty SB1 a dosahuje 60 % hydrolytické eficience wild-type. Připravené mutanty SB1 a SB2 b-glukosidasy Zm-p60.1 mohou sloužit jako nástroj k jemnému ovlivňování hladin cytokininů. Tyto a další připravené mutanty budou následně transformovány do rostlin určených ke studiu regulace cytokininové homeostáze.

Abstract:

The maize b-glucosidase (EC 3.2.1.21) Zm-p60.1 is an enzyme catalyzing the hydrolysis of trans-zeatin-O-glucopyranoside to glucose and trans-zeatin. This thesis is focused on the production, purification and partial characterization of the mutants SB1 and SB2 of Zm-p60.1. The thesis includes a theoretical part devoted to a review of the literature on purification of recombinant proteins involved in cytokinin metabolism of plant. The practical part contains part of the study of two obtained mutant forms of Zm-p60.1. The Zm-p60.1 mutants SB1 and SB2 were expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS-T1R and purified by affinity chromatography on a 5 ml HisTrap HP column followed by gel filtration on a HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade column to purities of > 95 %. Enzyme kinetics was measured at 30 °C with the artificial substrate pNPG: the values for the SB1 mutant were Km = 0.48 ± 0.02 mmol•l-1 and kcat = 12.94 ± 0.10 s-1. For SB2 the values were Km = 0.50 ± 0.02 mmol•l-1 and kcat = 19.12 ± 0.20 s-1. Hydrolytic efficiency of SB2 is about 30 % higher than SB1 and is equal to approximately 60 % of WT. These mutants of Zm-p60.1 can be a tool for subtle changes in cytokinin metabolism in plants. These and other mutated forms of Zm-p60.1 will be mobilized into transgenic plants as part of future research into the regulation of cytokinin homeostasis.

Keywords

b-glukosidasa, purifikace, rekombinantní protein, b-glucosidase, purification, recombinant protein

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 5. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2011
• Supervisor: prof. RNDr. Přemysl Lubal, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Chemistry / Chemistry