Studium acetylcholinesterasy metodami výpočetní chemie

Mgr. Jiří Wiesner, Ph.D.

Doctoral thesis

Investigation of Acetylcholinesterase by the Means of Computational Chemistry

Abstract:

Acetylcholinesterasa (EC 3.1.1.7) je dokonalý katalyzátor. Monomer tohoto enzymu je schopen hydrolyzovat přirozený substrát acetylcholin s rychlostí obratu výrazně převyšující 10 000 katalytických cyklů za sekundu. Už 80 let přitahuje tento enzym živý zájem výzkumníků z oblastí molekulární biologie, biochemie a lékařství. Nejvíce zkoumanými jevy jsou inhibice, katalytický mechanismus a reaktivace. V této dizertační práci je pro studium dynamiky acetylcholinesterasy v jejích různých protonačních stavech používána molekulová mechanika, molekulová dynamika, termodynamická integrace a výpočty potenciálu střední síly. Modely založené na molekulové mechanice s sebou nesou jedno výrazné omezení a to nemožnost měnit topologii chemických vazeb. Pro vyvážení tohoto nedostatku, bylo potřeba provést více simulací s různou vazebnou topologií – s různou protonací glutamových kyselin umístěných v aktivním místě (E202, E334 a E450). Při molekulové dynamice plně ionisovaného stavu došlo k výrazné změně konformace omega smyčky (C69-C96), zatímco v simulacích protonovaných stavů byla konformace omega smyčky i zbytků v aktivním místě značně stálejší. V simulaci plně ionisovaného stavu se sodným iontem umístěným do aktivního místa byla pozorována konformační změna W86, která odpovídá otevírání domnělých zadních vrátek v podobě závěrky, jež spojují dno aktivního místa s okolním rozpouštědlem. Plně ionisovaný stav byl na základě svých strukturních vlastností a výpočtů pKa aminokyselin E202, E334 a E450 určen jako nejméně výhodný – nejdůležitější chybějící interakcí by vodíková vazba mezi E202 a E450. Upřednostňovaný protonační stav acetylcholinesterasy byl určen jako stav s jednou nebo se dvěma ionisovanými aminokyselinami z možných tří – E202, E334 a E450. Pomocí výpočtů potenciálu střední síly bylo zjištěno, že rozdíl Helmholtzovy volné energie při úniku sodíkového kationtu ven z aktivního místa se liší pro různé protonační stavy enzymu. Rozdíl volné energie mezi anionickým místem na okraji a dnem aktivního místa se pohyboval mezi -7,9 kcal/mol (pro stav s protonovaným E450 a ionisovanými E202 a E334) a 4,4 kcal/mol (stav s protonovanými E202 a E334 a ionisovaným E450).

Abstract:

Acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7) is perfect catalyst. Single monomer of this enzyme hydrolyses the native substrate, acetylcholine, with a turnover rate by far exceeding 10,000 catalytic cycles per second. For about 80 years, this enzyme has drawn vivid interest of researchers from the fields of molecular biology, biochemistry and medicine. Inhibition, catalytic mechanism and reactivation of acetylcholinesterase are the most emphasised research topics. In this dissertation thesis, molecular dynamics, thermodynamic integration and potential of mean force calculations are used to study the dynamics acetylcholinesterase in its various protonation states. Since a molecular mechanics potential is employed to calculate potential energy in the simulations, there is a major limitation imposed by this model – fixed topology of chemical bonds. This shortcoming of the model is compensated by running multiple simulations of different bonding topology – of various proton configurations (protonation states) of active site glutamic acids (E202, E334 and E450). Molecular dynamics of the fully ionised state revealed extensive conformational changes of the omega loop (C69-C96), whereas the structure of both omega loop and active site was considerably more stable in simulations of the protonated states. Rotation of the side chain of W86, which is the most important residue of the putative “shutter-like” back door, was observed in the simulation of a fully ionised state with a sodium cation present in the active site. The calculation of pKa of E202, E334 and E450 identified the fully ionised state as the least favourable in terms of both energetic and structural properties – most importantly, the hydrogen bonding interaction of E202 and E450 was disrupted. It is predicted that one or two glutamic acid residues from E202, E334 and E450 would be ionised in the preferred protonation state of acetylcholinesterase. Potential of mean force calculations were carried out to investigate free energy changes connected with the transport of a sodium cation from the active site of acetylcholinesterase. Significantly different Helmholtz free energy profiles were found for each of the studied protonation states. The free energy difference between the peripheral anionic site and the gorge bottom ranges from -7.9 (state with a protonated E450 and ionised E202 and E334) to 4.1 kcal/mol (state with both E202 and E334 protonated and ionised E450).

Keywords

acetylcholinesterasa, acetylcholinesteráza, protein, enzym, kyselina glutamová, pKa, molekulová dynamika, molekulová mechanika, silové pole Amber, termodynamická integrace, volná Helmholtzova energie, potenciál střední síly, elektrostatické síly, PMF, TI, MD, acetylcholinesterase, enzyme, glutamic acid, molecular dynamics, molecular mechanics, Amber force field, thermodynamic integration, Helmholtz free energy, potential of mean force, electrostatic forces

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 11. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 16. 12. 2011
• Supervisor: prof. RNDr. Jaroslav Koča, DrSc.
• Reader: RNDr Michal Čajan, Ph.D, Mgr. Michal Kutý, Ph.D

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry