Odpověď na poškození DNA v BRCA1 deficientních buněčných liniích

Bc. Tereza BUCHTOVÁ

Master's thesis

DNA damage responses in BRCA1 deficient cell lines

Abstract:

BRCA1 je gen kódující lidský nádorový supresorový protein stejného jména, který hraje důležitou roli při udržování genomové stability. To zahrnuje aktivaci kontrolních bodů buněčného cyklu v odpovědi na poškození DNA a také samotnou opravu poškozené DNA. Některé zárodečné mutace v BRCA1 genu vedou u postižených jedinců k významné predispozici k malignitám, jakou jsou rakovina prsu a vaječníků. Cílem této diplomové práce bylo studium haploinsuficience BRCA1 v unikátním buněčném modelu v podobě primárních porcinních fibroblastů. Jedná se o buněčné linie s konstitucí alel BRCA1 +/ a k nim kontrolní BRCA1 +/+, jež byly získány z nedávno vytvořeného GMO prasete. Prase je vhodným modelovým organismem pro lékařský výzkum, a to díky jeho relativní fyziologické podobnosti člověku. Na rozdíl od myších modelů je však tvorba GMO prasat velmi náročná a teprve až s moderními systémy genových "knock-inů" a "knock-outů" je lze využít i pro výzkum specifických lidských nemocí jako je rakovina. U testovaných buněčných modelů byla nejprve optimalizována detekce a následně i srovnána míra exprese BRCA1 proteinu metodou western blotting. Linie byly dále testovány na citlivost vůči inhibitoru PARP1 enzymu, který patří mezi současná nejnadějnější léčiva ženských malignit. Inhibitory PARP1 se v terapii rakoviny ukazují jako obzvláště účinné v případech deficitu BRCA1 proteinu, kdy inhibice PARP1 enzymatické aktivity vede u postižených buněk k akumulaci toxického DNA poškození v podobě dvouvláknových DNA zlomů. Testy toxicity byly prováděny pomocí kolorometrické metody využívající druhou generaci tetrazoliových solí jejichž redukcí vzniká barevný formazan v důsledku metabolické aktivity buněk (tzv. XTT test). Dále byla u modelu pomocí kvantitativní imunofluorescenční mikroskopie analyzována efektivita opravy dvouvláknových zlomů DNA. Výběrem vhodných protilátek byla analyzována oprava DNA zlomů jak pomocí homologní rekombinace, tak i nehomologního spojování volných DNA konců. Rovněž byla analyzována odpověď na replikační stres vedoucí k zastavení a kolapsu replikačních vidlic. Protein BRCA1 byl úspěšně detekován ve všech testovaných liniích s nejsilnější expresí v linii 539 (+/+). Po podání inhibitoru PARP1 byla zaznamenána vyšší citlivosti haploinsuficientních linií. V případě efektivity oprav DNA lézí se podařilo optimalizovat a následně i kvantifikovat několik vhodných proteinových markerů, nicméně po ozáření buněk gama zářením se odpověď haploinsuficientních linií nelišila od kontrol. Také po expozici replikačnímu stresu nebyla u zkoumaných linií pozorována zásadně rozdílná akumulace defektní jedno-řetězcové DNA.

Abstract:

BRCA1 is a human tumour suppressor gene which product plays important role in maintaining of genomic stability. That includes DNA-damage-induced cell cycle checkpoint activation and DNA damage repair. Some of the germline mutation in BRCA1 gene predispose mainly to breast and ovarian cancer. The aim of this diploma thesis was to study an impact of haploinsufficiency of BRCA1 gene in a unique cellular model involving primary porcine fibroblasts. The used BRCA1 +/ and BRCA1 +/+ cell lines were derived from a recently developed GMO animals. The pig is an excellent model organism for medical research because of its physiological similarity with humans but instead of mouse models the GMO pig introduces much bigger technological challenge. The advanced technological solutions of knock-ins and knock-outs finally allow construction of cancer-relevant models. In the primary porcine fibroblasts, the BRCA1 protein detection was optimised and compared between cell lines using western blot method. Cell lines were also tested for their sensitivity towards the PARP1 enzyme inhibitor, which belongs to the most promising treatments strategies of the woman malignancies currently available. Inhibitors of PARP1 seems to particularly effective in BRCA1 deficient backgrounds which fact is explained as accumulation of toxic double-stranded DNA lesions caused by PARP1 enzyme blockade which repair is vastly dependent on BRCA1 protein. The sensitivity of the cell lines was analysed calorimetrically using the second generation of tetrasolium salts which are reduced to coloured formazan in the presence of metabolically active cells (XTT test). Next, the DNA lesions repair efficacy was analysed in the cell lines using quantitative imunofluorescence microscopy. The ability of cells to repair DNA lesions either by homologous recombination or by non-homologous enjoining explored in details. Cells were also flowed under the replication stress conditions which are causing stalling and collapses of replication forks and accumulation of single stranded DNA. The BRCA1 protein was successfully detected in all tested porcine fibroblasts with the strongest expression in 539 (+/+) cell line. After the treatment with PARP1 inhibitor the haploinsufficient cell lines display higher sensitivity. In case of the repair efficacy of DNA lesions few antibodies were optimized against proper DNA lesion markers but the quantification of gamma irradiation induced DNA damage did not reveal any differences between the tested cell lines. Also the exposition of cells towards replication stress displayed constant increase in the amount of defective single stranded DNA throughout the all tested cell lines.

Keywords

BRCA1, rakovina, haploinsuficience, odpověď na poškození DNA, dvouvláknové DNA zlomy, mutace, porcinní model

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Dušana Majera, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology