Strukturní charakterizace proteinů interagujících s vnitřně neuspořádaným mykobakteriálním iniciačním faktorem transkripce Sigma-A a mikrotubulární vazebnou bílkovinou 2c

Subhash Narasimhan, Ph.D.

Doctoral thesis

Structural Characterization of Proteins Interacting with Intrinsically Disordered Mycobacterial Transcription Initiation Factor Sigma-A and Microtubule Binding Protein 2c

Abstract:

Vnitřně neuspořádané proteiny (IDP) jsou třídou proteinů, které nemají pevnou trojrozměrnou strukturu a místo toho existují v dynamickém souboru konformací. IDP se podílejí na mnoha funkčních úlohách, jako je přenos signálu, regulace transkripce a buněčné dělení po interakci s uspořádaným partnerem. Protein sigma-A (σA) je bakteriální transkripční faktor, který hraje zásadní roli při iniciaci transkripce tím, že se asociuje s RNA polymerázou (RNAP) řídící iniciaci transkripce. Prostřednictvím nestranného hledání interakčních partnerů M. smegmatis σA byla objevena řada proteinů, z nichž nejvýznamnější byl MoaB2. MoaB2 je členem univerzálně konzervované rodiny proteinů, která se podílí především na cestě inkorporace molybdenu, stopového prvku u bakterií. Struktura M.smegmatis MoaB2 byla vyřešena pomocí rentgenové krystalografie. Strukturní analýza vazby MoaB2 pomocí NMR spektroskopie odhalila, že v interakci σA-MoaB2 hraje klíčovou roli jedinečná, nestrukturovaná N-koncová doména σA. Funkční experimenty z naší spolupráce prokázaly, že MoaB2 specificky inhibuje transkripci závislou na σA a zvyšuje biologickou stabilitu σA. Souhrnně lze říci, že tato studie odhalila MoaB2 jako nového vazebného partnera mykobakteriálního σA, který si osvojil alternativní funkci u prokaryot. Microtubule associated protein 2c (MAP2c), vnitřně neuspořádaný protein je juvenilní sestřihová varianta genu MAP2, předpokládá se, že reguluje růst dendritu v neuronech vyvíjejícího se mozku. Mikrotubulární vazebná doména (MTBD) konzervovaná mezi MAP se podílí na regulaci dynamické nestability mikrotubulů. MTBD MAP2c vykazuje vysokou sekvenční homologii s Tau, ale MAP2c netvoří agregáty, jaké se nacházejí v mozcích pacientů trpících Alzheimerovou chorobou. MAP2c je regulován četnými posttranslačními modifikacemi pomocí předřazených regulačních proteinů, jako jsou serin-treonin kinázy, tyrosin kinázy, prolin-směrové kinázy, regulační protein 14-3-3 a neurosteroidy. Nedávné studie v naší laboratoři ukázaly, že izoforma 14-3-3ζ různě soutěží s mikrotubuly na MTBD MAP2c a tau. Abychom lépe pochopili přechodné strukturní rysy interakce MTBD MAP2c s mikrotubuly, provedli jsme kryoEM rekonstrukci MAP2c s prasečími mikrotubuly ve vysokém rozlišení. Další část projektu se zabývala objasněním struktury krátkých peptidů MAP2c a jejich interakcí s 14-3-3(ζ) pomocí rentgenové krystalografie. Celkově tato zjištění prohlubují naše chápání úlohy MAP2c v neuronálním vývoji a regulaci a vytvářejí základ pro budoucí zkoumání jeho terapeutických důsledků.

Abstract:

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are a class of proteins that lack a fixed three-dimensional structure and instead exist in a dynamic ensemble of conformations. IDPs are involved in multiple functional roles such as signal transduction, transcriptional regulation, and cell division upon interaction with an ordered partner. The sigma-A (σA) protein is a bacterial transcription factor that plays a vital role in the initiation of transcription by association with RNA polymerase (RNAP) driving transcription initiation. Through an unbiased search for interacting partners of M. smegmatis σA, a number of proteins were discovered, with MoaB2 being the most prominent. MoaB2 is a member of a universally conserved protein family that is mainly involved in the Molybdenum incorporation pathway, a trace element in bacteria. M.smegmatis MoaB2 structure was solved by means of X-ray crystallography. The structural analysis of MoaB2 binding by means of NMR spectroscopy revealed that the unique, unstructured N-terminal domain of σA plays a crucial role in the σA-MoaB2 interaction. Functional experiments from our collaboration demonstrated that MoaB2 specifically inhibits σA-dependent transcription and increases the biological stability of σA. In summary, this study uncovered MoaB2 as a novel binding partner of mycobacterial σA, which has adopted an alternate function in prokaryotes. Microtubule associated protein 2c (MAP2c), an intrinsically disordered protein is a juvenile splicing variant of the MAP2 gene is assumed to regulate growth of dendrite in neurons of developing brain. The microtubule binding domain (MTBD) conserved among MAPs is involved in regulating dynamic instability of microtubules. MTBD of MAP2c exhibits a high sequence homology with Tau, but MAP2c does not form aggregates like those found in brains of patients suffering from the Alzheimer's disease. MAP2c, is regulated by numerous post-translational modifications by upstream regulatory proteins such as serine threonine kinases, tyrosine kinase, proline-directed kinases, regulatory protein 14-3-3 and neurosteroids. Recent studies in our lab showed that 14-3-3ζ isoform competes differently with microtubules at the MTBD of MAP2c and tau. To better understand the transient structural features of MAP2c MTBD interaction with microtubules, we performed high resolution cryo-EM reconstruction of MAP2c with porcine microtubules. Another scope of the project explored the structural elucidation of MAP2c short peptides and their interaction with 14-3-3(ζ) by means of X-ray crystallography. Altogether, these findings deepen our comprehension of MAP2c's role in neuronal development and regulation, laying the groundwork for future investigations into its therapeutic implications.

Keywords

Czech, MAP2c, IDP, mykobakterie, transkripce, MoaB2, Sigma-A, Vnitřně neuspořádaná oblast, přechod mezi neuspořádaností a uspořádaností, nukleární magnetická rezonance, rentgenová krystalografie, kryoelektronová mikroskopie. English, Mycobacterial, Transcription, Intrinsically disordered region, Disorder-to-order transition, Nuclear magnetic resonance, X-ray crystallography, cryo-electron microscopy.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 7. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 7. 8. 2024
• Supervisor: prof. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.
• Reader: Ph.D. Svetlana Antonyuk, prof. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D., RNDr. Rostislav Škrabana, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Life Sciences / Life Sciences