Výběr a optimalizace metody pro laboratorní průkaz Mycobacterim tuberculosis H37 Rv ve vzorcích sputa

Bc. Lucie Krawiecová

Master's thesis

Selection and optimalization method for laboratory certificate Mycobacterium tuberculosis in samples of sputum

Abstract:

Cílem diplomové práce bylo stanovit poměr citlivosti mezi metodou NASBA Gen-Probe (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) a metodou Real Time PCR Gene Proof (Real Time Polymerase Chain Reaction). Dalším cílem předložené práce bylo vytvořit souvislou suspenzi z Mycobacterium tuberculosis (MT) H37 Rv ve fyziologickém roztoku potřebnou k přípravě ředění, které bylo nezbytné pro stanovení citlivosti mezi oběma molekulárně-genetickými metodami. První část předložené práce se zabývala vytvořením souvislé suspenze z Mycobacterium tuberculosis H37 Rv (MT roste v provazcích tyčinek, které silně drží pohromadě a obtížně se suspendují) ve fyziologickém roztoku. K vytvoření souvislé suspenze bylo použito skleněných kuliček, ultrazvukové vany (o výkonu 4 W) a ultrazvukové sondy (o výkonu 100 W). V ultrazvukové vaně byly shluky rozbíjeny 5, 10, 15, 30, 45, 50 min. Skleněnými kuličkami se rozbíjely mykobakteriální shluky pomocí vortexu po dobu 30, 60, 90, 120 s při zvyšujících se otáčkách 1000, 1500, 2000, 2500. V případě ultrazvukové sondy se shluky rozbíjely 2, 4, 6, 8 minut. Hodnoty získané mikroskopií vypovídaly, že nejlépe oddělené mykobakteriální tyčinky byly po homogenizaci ultrazvukovou sondou po dobu 6 min a po homogenizaci kuličkami po dobu 120 s při 2500 otáčkách. Proto byly vytvořeny dvě základní suspenze (ZS), v nichž byly shluky rozbíjeny kuličkami (120 s při 2500 otáčkách) a ultrazvukovou sondou po dobu 6 min. Z těchto ZS bylo připraveno ředění do 5-ti zkumavek (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ). Směs připravena ze slitých sput a N-acetyl-L-cysteinu (8 ml) byla smíchána vždy s jednou zkumavkou (4 ml) připraveného ředění a dekontaminačním roztokem (4 ml). Po dekontaminaci byl resuspendovaný sediment použit pro metody NASBA a Real Time PCR. Druhá část práce se zabývala srovnáním metod NASBA a Real Time PCR. V případě metody NASBA se pracuje s celým obsahem sputa. U metody Real Time PCR se používá mykobakteriální DNA izolována kolonkovou metodou. Ze získaných výsledku obou metod je zřejmý rozdíl v citlivosti. Metoda NASBA vychází pozitivní do ředění 10-3 (1:1000) a výsledky Real Time PCR vychází pozitivní v nejvyšším ředění (10-5 = 1:100 000). Z uvedených výsledku je tedy patrné, že metoda Real Time PCR je citlivější než metoda NASBA.

Abstract:

Aim of disertation was to determine sensitivity ratio between method NASBA Gen-Probe (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) and commercial method Real Time PCR Gene Proof (Real Time Polymerase Chain Reaction). Another aim of submitted work was to make continuous suspension from Mycobacterium tuberculosis (MT) H37 Rv and physiological solution needed to preparation dilution, which was necessary for determination sensibilities between both molecular-genetical methods. First part of submitted work deals with creation of continuous suspension from Mycobacterium tuberculosis H37 Rv clumps and physiological solution. Continuous suspension was made by using glass bullets, ultrasonic baths (about 4 W) and ultrasonic probe (about 100 W). In ultrasonic bath were clumps breaking for 5, 10, 15, 30, 45, 50 mins. Glass bullets were breaking clumps by the help of vortex for a time period of 30, 60, 90, 120 s with raising speed 1000, 1500, 2000, 2500. In the event of ultrasonic probe, clumps were breaking for 2, 4, 6, 8 minutes. Results gained by microscopy reflected that the best separate mycobacterial bacilli were after incidence ultrasonic probe after time of 6 min. and after breaking bullets for time period of 120 s on 2500 speed. Therefore were made two suspension, where were clumps breaking by bullets (120 s on 2500 speed) and ultrasonic probe for time period of 6 min. From these two suspensions were made dilution to the 5 test tubes (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ). Mixture was made from sputum and N- acetyl- L- cysteine (8 ml) mixed always with one test tube (4 ml), which was made by dilution and decontamination solution (4 ml). After decontamination was resuspended sediment used for method NASBA and Real Time PCR. Second part of work deals with course methods NASBA and Real Time PCR. In the event of method NASBA we work with whole quantity of sputum. In Method Real Time PCR is used mycobacterial DNA isolated by kolony method. From gained result from both molecular methods is evident difference in sensibilities of methods. Method NASBA is positive as far as concentration is 10-3 (1:1000) and from results Real Time PCR is positive even the lowest concentration (10-5 = 1:100 000). From the mentioned result is then evident, that method Real Time PCR is more sensitive than method NASBA.

Keywords

Mycobacterium tuberculosis H37 Rv, NASBA, Real Time PCR, mikroskopie, kultivace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 5. 2007

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2007
• Supervisor: RNDr. Václav Mareš

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / General Biology