Využití molekulárně biologických metod při diagnostice cytomegaloviru (CMV)

Erika ŠIMEROVÁ

Bachelor's thesis

The application off molecular biological methods in diagnosing the cythomegalovirus in the clinical matherials

Abstract:

Lidský cytomegalovirus (HCMV nebo CMV) je lidský virový patogen ze skupiny herpetických virů, které se nacházejí v rozvinutých i méně rozvinutých společnostech a u všech věkových skupin. V této práci bylo porovnáváno kvalitativní stanovení DNA CMV pomocí dvou metod PCR. Jednou z nich byla in house metoda. Zde se pomocí nested PCR se dvěma páry specifických primerů amplifikují úseky virové DNA CMV, které jsou následně detekovány na agarózovém gelu. Vizualizace takto získaných produktů PCR na agarózovém gelu se děje za pomocí interkalačního činidla ? ethidium bromidu. Tato metoda je velmi citlivá, ale časově náročná. Jako druhá metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV byla použita metoda real-time PCR na přístroji Rotor Gene. Detekce probíhá v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázána na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce PCR produktů je prováděna na základě intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase. Systém je zároveň schopen identifikovat potenciální PCR inhibici za přítomnosti interní kontroly. Tato metoda se jeví jako časově výhodnější, proto byla zavedena jako běžně užívaná metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV. Metody nested PCR a real-time PCR mají srovnatelnou citlivost a jsou srovnatelné i po finanční stránce. Pro jejich srovnání bylo použito 150 vzorků krve a krevní plazmy od 75 jedinců. Záchyt DNA CMV byl srovnatelný. Jen v jednom případě nebyl zachycen pozitivní výsledek u metody real-time na přístroji Rotor Gene, zatímco metoda nested PCR jej zachytila. I tak se metoda real-time PCR jeví jako velmi výhodná metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV a to i díky používání interních kontrol.U pacientů po transplantacích, u novorozenců, u onkohematologických pacientů je třeba kvůli léčbě provádět kvantitativní stanovení DNA CMV. V této práci byla pro kvantitativní stanovení používána metoda real-time PCR na přístroji Light Cycler. CMV LC Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 105bp dlouhého úseku genomu CMV a také pro bezprostřední detekci amplifikátu pomocí přístroje Light Cycler. I zde se nachází amplifikační systém pro průkaz potenciální PCR inhibice založený na detekci interní kontroly. Analytický limit detekce přitom není negativně ovlivněn. Množství CMV viru ve vzorku se určuje pomocí kvantifikovaných standard, které jsou součástí kitu. Analyzátor vypočítává titr virové DNA v testovaných vzorcích porovnáním signálu u každého vzorku se signálem kvantitativního standardu, jenž je přiřazen ke kalibrační křivce daného balení kitu. Kvantitativní stanovení se pak uvádí v množství kopií/1 ml vzorku. Právě na základě monitorinku kvantitativního stanovení se u pacientů určuje délka léčby CMV infekce. Izolace DNA lze provádět ručně nebo pomocí automatických přístrojů ? izolátorů.Ve své práci jsem se zaměřila na srovnání těchto dvou odlišných izolací. Ruční izolaci jsem prováděla pomocí izolačního QIAmp DNA Mini Kitu od firmy QIAGEN. Automatizovanou izolaci jsem prováděla na izolátoru MagCore za použití MagCore Genomic DNA whole Blood Kitu (RBCBioscience). Pro srovnání obou izolací byly současně použity jako klinické materiály krev a krevní plazma vždy od stejného jedince. Obě metody izolací pak byly následně použity pro kvalitativní i kvantitativní stanovení CMV DNA. Z výsledků kvantitativních stanovení vyplývá, že obě použité izolace jsou srovnatelné, tzn. lze použít obě izolace se stejným kvantitativním výsledkem.

Abstract:

Human cytomegalovirus (HCMV or CMV) is a human viral pathogen from a group of herpetic viruses. Isolation of DNA can be done manually or with the automatic machines - isolators. In my work I concentrated to compare these two different isolations. I did manual isolation with the help of impervious QIAmp DNA Mini Kitu made by QIAGEN and automatic isolation with isolator MagCore using MagCore Genomic whole Blood Kit (RBCBioscience). To compare the isolations blood and plasma were used as clinical materials and their origin was the same. Both methods were used afterwards to set up the qualitative and comparative CMV DNA. The result means that both isolations are comparable - both can be used with the same quantitative result. In this work there is also compared the qualitative determination DNA CMV by using two PCR methods. One of them was the "In house" method in which are two sections of viral DNA CMV ampificated by the couples of specific primers and later there are detected by the agarose gel. Visualisation of these products on agarose gel is going on with the help of intercalatial reagent - ethidium bromide. This method is very sensible but it takes a lot of time.

Keywords

CMV, cytomegalová infekce, PCR, real-time PCR, kvalitativní stanovení, kvantitativní stanovení

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 8. 2013

Accessible from:: 14. 8. 2013

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Natalja Piskunova, CSc.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Zdravotní laborant