Characterization of structure and interactions of proteins involved in neurodegenerative diseases

Mgr. Aneta Kozeleková, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Alzheimerova choroba (AD) je nejčastěji se vyskytujícím druhem neurodegenerativních onemocnění, které se vyznačuje přítomností amyloidních plaků a neurofibrilárních shluků (NFTs) v mozku pacienta. Amyloidní plaky se skládají z agregovaných peptidů amyloidu β (Aβ), zatímco NFTs obsahují převážně fibrily agregovaného Tau proteinu. Navíc byly v těchto patologických strukturách nalezeny 14-3-3 proteiny. Ačkoli jsou symptomy a patologické znaky známy již desítky let, molekulární mechanismus AD zůstává dosud ne zcela pochopen a onemocnění je většinou nevyléčitelné. 14-3-3 proteiny jsou dimerní regulační proteiny, hojně exprimované v lidském mozku. Interagují s fosforylovanými proteinovými partnery a upravují jejich aktivitu. Předpokládalo se, že fosforylace na S58 (pS58) – aminokyselině na dimerním rozhraní – způsobuje monomerizaci 14-3-3 proteinu a ovlivňuje jeho funkci. Kvůli problémům s přípravou vzorku však nebylo možné vlastnosti 14-3-3 pS58 proteinu prostudovat, a proto se v předchozích studiích velmi často používaly fosfomimikující a monomerní mutanty. V této práci se nám podařilo připravit 14-3-3 protein plně a specificky fosforylovaný na S58 a charakterizovat jeho biofyzikální, strukturní a interakční vlastnosti. Odhalili jsme výrazné rozdíly ve srovnání s fosfomimikujícími mutanty, což naznačuje, že fosfomimikující mutace v tomto případě nespolehlivě napodobují účinky skutečné fosforylace. Pomocí spektroskopie nukleární magnetické rezonance (NMR) jsme zkoumali strukturu 14-3-3 pS58 a jeho interakci s (fosforylovaným) Tau proteinem a Aβ peptidem s rozlišením na úrovni jednotlivých aminokyselin. V případě Tau jsme objevili dvě nová sekundární interakční místa na povrchu 14-3-3. Tau protein je vnitřně neuspořádaný protein, známý svou nadměrnou fosforylací a abnormální posttranslační modifikací během AD. Předpokládá se, že tyto posttranslační modifikace (PTMs) jsou zapleteny do spuštění agregace Tau proteinu. V této studii jsme zkoumali vliv fosforylace na strukturní preference Tau v roztoku a zmapovali jsme vazebné místo monomerních a dimerních 14-3-3 proteinů pomocí NMR spektroskopie a chemického zesíťování následovaného hmotnostní spektrometrií (MS). Rovněž jsme stanovili vazebné afinity a stechiometrie a pozorovali jsme rozdíly mezi jednotlivými variantami 14-3-3 a různě fosforylovanými Tau proteiny. Navíc jsme studovali interakci mezi 14-3-3 dimery/monomery a fosforylovaným proteinem MAP2c, který je homologem Tau, avšak netvoří fibrilární agregáty. Jelikož byly 14-3-3 proteiny nalezeny v agregátech Tau a Aβ v mozcích pacientů postižených AD, zajímala nás jejich vzájemná souhra během agregačního procesu. Zjistili jsme, že 14-3-3 proteiny potlačují agregaci jak Tau, tak Aβ peptidu. V případě Aβ peptidu byl monomer 14-3-3 proteinu účinnějším inhibitorem agregace než dimer. Kromě toho jsme zkoumali molekulární podstatu inhibice agregace a navrhli mechanismus chaperonové aktivity 14-3-3 proteinů. Vzhledem k tomu, že profil PTM Tau proteinu relevantního pro AD je velmi komplexní, ale s velkou pravděpodobností důležitý, pokusili jsme se připravit Tau protein s využitím savčích buněk jako expresního systému. Analyzovali jsme PTM Tau proteinu pomocí MS a odhalili jsme podobnosti s Tau proteinem relevantním pro AD. Provedli jsme také pilotní experimenty charakterizující interakce a agregaci Tau ze savčích buněk a srovnali jsme je s Tau rekombinantně připraveným v E. coli a in vitro fosforylovaným vybranými kinázami. Navzdory některým omezením představuje tento přístup pro přípravu Tau slibnou cestu pro další výzkum AD.

Abstract:

Alzheimer's disease (AD) is the most frequent type of neurodegenerative disorder, characterized by presence of amyloid plaques and neurofibrillary tangles (NFTs) in the patient’s brain. The amyloid plaques consist of aggregated amyloid β (Aβ) peptides, while the NFTs mainly contain fibrils of aggregated Tau proteins. In addition, 14-3-3 proteins were found co-localized in these pathological structures. Although the symptoms and the pathological hallmarks are already known for decades, the molecular mechanism of AD remains not fully understood and the disease is mostly incurable. 14-3-3 proteins are dimeric regulatory proteins, abundantly expressed in the human brain. They interact with phosphorylated protein partners and modulate their activity. Phosphorylation at S58 (pS58) – a residue buried at the dimeric interface – was suspected to induce 14-3-3 protein monomerization and impact 14-3-3 function. However, due to sample preparation issues, the study of 14-3-3 pS58 properties was not feasible and very often phosphomimicking and monomeric mutants were used in the previous studies. In this work, we successfully prepared fully and specifically S58-phosphorylated 14-3-3 protein and characterized its biophysical, structural and interaction properties. We revealed significant differences compared to phosphomimicking mutants, indicating that the phosphomimicking mutations in this case do not reliably approximate the effects of real phosphorylation. Using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, we inspected the structure of 14-3-3 pS58 and its interaction with (phosphorylated) Tau protein and Aβ peptide with single-residue resolution. In case of Tau, we discovered two novel secondary interaction sites on the 14-3-3 surface. Tau protein is an intrinsically disordered protein known to be hyperphosphorylated and abnormally post-translationally modified during AD. The post-translational modifications (PTMs) are suspected to be implicated in the induction of Tau aggregation. In this study, we examined the impacts of phosphorylation on the structural preferences of Tau in solution and mapped the binding site of monomeric and dimeric 14-3-3 proteins using NMR spectroscopy and chemical cross-linking followed by mass spectrometry (MS). We also determined the binding affinities and stoichiometries and observed differences between individual 14-3-3 variants and variously phosphorylated Tau proteins. In addition, we studied the interaction between 14-3-3 dimers/monomers and phosphorylated MAP2c protein, which is a Tau homologue that does not form fibrillar aggregates. Since the 14-3-3 proteins were found in Tau and Aβ aggregates in the brains of AD patients, we were interested in their mutual interplay during the aggregation process. We discovered that 14-3-3 proteins suppress aggregation of both Tau and Aβ peptide. In case of Aβ peptide, 14-3-3 monomer was more potent inhibitor of aggregation than dimer. Moreover, we inspected the molecular basis of the aggregation inhibition and proposed the mechanism of the chaperone-like activity of 14-3-3 proteins. Finally, as the PTM pattern of AD-relevant Tau is very complex, but most likely important, we attempted to prepare the Tau protein using mammalian cells as the expression system. We analyzed its PTMs using MS and revealed similarities with the AD-relevant Tau. We also performed pilot experiments characterizing the interactions and aggregation of Tau from the mammalian cells and compared them to recombinantly prepared Tau in E. coli and in vitro phosphorylated by selected kinases. Despite several limitations, this approach of Tau preparation represents a promising pathway for further AD research.

Keywords

14-3-3ζ protein, pS58, fosforylace, fosfomimikující mutace, dimerizace, monomerizace, Tau protein, MAP2c protein, Aβ40 peptid, interakce, agregace, spektroskopie nukleární magnetické resonance, buňky HEK293, Alzheimerova choroba, phosphorylation, phosphomimicking mutations, dimerization, monomerization, Aβ40 peptide, interaction, aggregation, nuclear magnetic resonance spectroscopy, HEK293 cells, Alzheimer’s disease

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2026

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 7. 2026
• Vedoucí: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Oponent: RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D., Dr. Jo Woodcock

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Vědy o živé přírodě / Vědy o živé přírodě