Biological properties of the hyaluronan-tyramine hydrogel for cartilage tissue replacement

Mgr. Lukáš Kučera, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Traumatická poranění chrupavky jsou problematická z důvodů vrozené nízké regenerační schopnosti chrupavky. Poraněná chrupavka tak degraduje nebo je nahrazena vazivovou chrupavkou, která má nižší funkční i mechanické vlastnosti. Tkáň vazivové chrupavky však nevratně degeneruje a časem podléhá osteoartritickým změnám. Metoda autologní chondrocytární implantace (ACI) zavedená Brittbergem v roce 1994 byla první technikou, která vedla k vyhojení chrupavkových defektů tkání podobnou hyalinní chrupavce. Přes nepochybný pokrok v léčbě chrupavkových defektů byla ACI technika doprovázena i nežádoucími účinky, např. hypertrofií implantátu nebo únikem chondrocytů z pod periosteálního krytu. Pro zamezení úniku chondrocytů z defektu se hydrogely zdály být ideálním kandidátem jako imobilizační médium. Hydrogely se dají připravit z materiálů přírodního či syntetického původu. Hydrogely založené na hyaluronanu (HA) jsou slibným materiálem pro léčbu chrupavkových defektů neboť HA je přirozenou součástí chrupavky během vývoje i v dospělosti. V naší práci jsme použili pro imobilizaci buněk tyraminový derivát HA (HA-TA), který umožňuje síťování a tvorbu hydrogelu za podmínek in vivo a současně in situ. Společně s chondrocyty jsme testovali mesenchymální kmenové buňky (MSC) jako alternativní zdroj buněk, které lze implantovat v HA-TA hydrogelu do místa defektu chrupavky. Chondrocyty, které jsou použity jako zdroj buněk pro léčbu chrupavkovitého defektu jsou izolovány z biopsií chrupavky, což tkáň dále poškozuje. Chondrocyty navíc během expanze in vitro mění svůj fenotyp a jejich kultivace je časově náročná. Změny chondrocytárního fenotypu jsou spojeny s poklesem exprese funkčních proteinů, jako je např. kolagen typu II. Tyto změny pak vedou k nedostatečné reparaci tkáně po chirurgickém zákroku. Na rozdíl od chondrocytů můžou být MSC odebrány z různých tkání bez rizika poškození chrupavky. MSC také nestrácejí chondrogenní potenciál během in vitro expanze a lze je diferencovat do chondrocytární linie za použití růstových faktorů. První naší pracovní hypotézou bylo, že HA-TA derivát může být slibným materiálem, který podporuje chondrogenezi MSC buněk za přítomnosti transformujícího růstového faktoru (TGF-β)-3 a může být dále podpořena za přítomnosti dalšího růstového faktoru - kostního morfogenetického proteinu (BMP)-6. Naší další hypotézou byl předpoklad, že HA-TA hydrogel podporuje chondrocytární fenotyp MSC buněk a může být použít jako nosič buněk při léčbě chrupavkových defektů pomocí ACI techniky. Pro ověření naší hypotézy jsme kultivovaly MSC buňky v médiu s obsahem růstových faktorů TGF-β3 a TGF-β3 v kombinaci s BMP-6. Proces chondrogeneze jsme monitorovali pomocí relativní genové exprese vybraných genů a dále za pomocí histologických a imunohistologických metod. Pro testování biokompatibility a biodegradability jsme provedli in vivo implantaci MSC buňkami osetého i neosetého HA-TA hydrogelu do podkoží potkana. Tento proces jsme sledovali pomocí histologických a imunohistologických metod. Pro sledování vlivu HA-TA hydrogelu na chondrocyty jsme provedli sledování viability buněk a tento proces jsme monitorovali in vitro pomocí relativní genové exprese vybraných genů a dále za pomocí histologických a imunohistologických metod. Dále jsme sledovali in vivo reakci na HA-TA hydrogel u indukovaného osteochondrálního defektu na králičím modelu. Tento proces jsme sledovali za pomocí histologických a imunohistologických metod. In vitro experimenty provedené s HA-TA hydrogelem potvrdili, že tento materiál je cytokompatibilní jak pro MSC, tak i pro chondrocyty. U MSC byla indukována chondrogeneze, která byla potencovaná přídavkem BMP-6 k médiu obsa

Abstract:

hujícím již TGF-β3. Chondrocyty kultivované v HA-TA hydrogelu produkovaly glykosaminoglykany a dále kolagen typu II i kolagen typu I bez známek hypertrofie. Chondrocyty vykazovaly snížení exprese pro geny matrixových metaloproteináz -1 a -3 při současném zvýšení exprese matrixové metaloproteinázy -13. In vivo studie potvrdily biokompatibilitu a bidegradabilitu HA-TA hydrogelu při testech v podkoží potkana. In vivo studie u osteochondrálního defektu na femuru králíka ukázaly rychlejší vyhojení defektu po ošetření lyofilizovaným HA-TA hydrogelem, ačkoliv pro přítomnost kolagenu typu I se jedná o vazivovou tkáň. Souhrnem lze uvést, že výsledky získané během provedených studií nás vedou k přesvědčení, že HA-TA hydrogel je netoxický, biokompatibilní a biodegradabilní materiál. HA-TA hydrogel se jeví jako slibný materiál, který lze použít k regeneraci poškozené chrupavky.

Abstract:

Traumatic cartilage injuries are problematic due to the low innate regeneration capacity of hyaline cartilage. After the injury, the cartilage degrades or is replaced by fibrocartilaginous tissue with inferior functional and mechanical properties. Nevertheless, fibrocartilage further irreversibly degenerates over the time and osteoarthritic changes take place slowly. The autologous chondrocyte implantation (ACI), the double-surgery method introduced by Brittberg in 1994 was the first technique which led to healing of injured cartilage with hyaline-like tissue. The original ACI technique was accompanied with complications (e.g. graft hypertrophy or chondrocyte leaking out of the covered defect), thus the ACI method was further improved in order to overcome complications associated with original Brittbergs’ ACI procedure. To prevent chondrocyte leaking out of the defect site hydrogels were found as ideal candidates for cell immobilization. Among the hydrogels of both natural and synthetic origin the hyaluronan (HA)-based hydrogels are frequently used. HA-based tissue substitutes are promising materials in cartilage reconstruction surgery as HA is an abundant component of terminal as well as developing cartilage and thus provides a natural milieu for chondrogenic cells. We therefore used HA-tyramine (HA-TA) derivative hydrogel for cell immobilization, which offer the possibility to be advantageously prepared in vivo and in situ directly in the cartilage defect site. Concomitantly with chondrocytes, we also tested mesenchymal stem cells (MSC) as an alternative cell source intended for immobilization in HA-TA hydrogel. Chondrocytes are harvested exclusively from cartilage by invasive procedure which further impairs already damaged tissue. In addition, in vitro expansion of chondrocytes is time consuming and tends to change their phenotype, which is associated with decrease in cartilage-specific collagen type II production leading to unsatisfactory healing response after implantation in vivo. By contrast to chondrocyte, MSC may be harvested from various sources without influencing the cartilage. MSC also do not lose the chondrogenic potential during in vitro expansion, and may undergo chondrogenesis after growth factor treatment. Taken together, we therefore hypothesized that HA-TA derivative may be promising scaffolding material to support chondrogenesis of MSC under influence of transforming growth factor-beta (TGF-β)-3. We also hypothesized that in vitro chondrogenesis may be further enhanced by the influence bone morphogenetic protein (BMP)-6.Furthermore, we hypothesized that HA-TA hydrogel will support the chondrogenic phenotype and may be used for cell-based treatment of cartilage injuries as a part of ACI technique, incumbent of the benefits of the in situ hydrogel cross-linking concept. In order to evaluate our hypothesis we tested viability MSC encapsulated in HA-TA hydrogel and the progress of chondrogenesis of MSC under the influence of TGF-β3 and TGF β3/BMP-6. The process of chondrogenesis was determined by the expression of selected genes and by histological and immunohistological methods. The biocompatibility and biodegradability of HA-TA hydrogel in in vivo rat model were analyzed by histological and immunohistological methods. In order to evaluate the influence of HA-TA hydrogel on chondrocytes we tested viability of chondrocytes encapsulated in HA-TA hydrogel. We also monitored the development and differentiation state of chondrocytes encapsulated in HA-TA hydrogel by the relative gene expression of selected genes and by histological and immunohistological methods. To reveal the in vivo reaction to HA-TA derivative we induced osteochondral defect in rabbit model and observed the healing response by histological and immunohistological methods. Various experiments with HA-TA hydrogel revealed its cyto-compatibility with both MSC and chondrocytes. MSC underwent chondrogenesis in vitro and beneficial effect of BMP-

Abstract:

6 addition to culture media during the early phase of chondrogenesis was observed. Chondrocytes cultivated in vitro were able to produce and accumulate glycosaminoglycans and collagen type II but also collagen type I inside the HA-TA hydrogel, without tendency to hypertrophy. Chondrocytes also decrease the transcription of matrix metalloproteinase (MMP)-1 and MMP-3 genes, and surprisingly increase transcription of only MMP-13 gene. All together these data clearly support the advantage of in vitro chondrogenesis of MSC and chondrocyte development inside the tested HA-TA hydrogel scaffolds. In vivo study confirms the biocompatibility and biodegradability of HA-TA scaffold implanted subcutaneously in rat dorsum. In vivo study of HA-TA scaffold implanted into osteochondral defect in rabbit model revealed faster healing of defect with sufficient integration of implant and native cartilage, although the neo-formed tissue filling the defect site may be considered as fibrocartilage. Alltogether these data from in vivo studies suggest good biocompatibility and biodegradability of HA-TA scaffold. Based on our results we conclude that HA-TA hydrogel is non-cytotoxic, biocompatible and bioresorbable material. HA-TA hydrogel would be therefore promising scaffolds intended for cartilage tissue engineering.

Keywords

cartilage, chondrocyte, hyaluronan, cartilage defect, autologous chondrocyte implantation, injectable in situ forming hydrogel, mesenchymal stem cell, in vivo test, biocompatibility, biodegradability, rabbit, osteochondral defect

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 9. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 20. 2. 2015
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: doc. MUDr. Miroslava Sedláčková, CSc., Ing. Lucie Vištejnová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology