Optimalizace PCR technik pro detekci včelích patogenů

Bc. Kristýna MYSLÍNOVÁ

Master's thesis

Optimization of PCR techniques for detection of honey bee pathogens

Abstract:

Včelí patogeny patří mezi faktory, které nepříznivě ovlivňují zdraví včel. Screening včelích patogenů je důležitý pro včasné rozpoznání nákazy, jejímuž šíření pak lze jednodušeji zabránit. Pro detekci včelích patogenů se nejčastěji používá PCR. Mezi její nevýhody ale patří vysoká cena vybavení, citlivost na kontaminanty a nutnost tepelného cyklování. Izolace DNA předcházející PCR je v případě použití komerčních kitů také poměrně nákladná. Levnější a časově méně náročnou alternativou izolace DNA mohou být FTA karty umožňující dlouhodobé uskladnění DNA při laboratorní teplotě. Alternativou samotné PCR pak může být metoda izotermní amplifikace zprostředkované smyčkou (LAMP), umožňující velmi rychlou amplifikaci za izotermních podmínek. V experimentální části práce bylo optimalizováno použití FTA karet pro uchování homogenátů včel a jejich následné zpracování pro PCR aplikace. FTA karty byly spolu s DNA-izolačním kitem DNeasy Plant Mini kit použity pro detekci pěti vybraných patogenů v podzimních a jarních vzorcích včel. FTA karty byly vyhodnoceny jako rychlejší a levnější alternativa k izolačním kitům. Dále byla vypočítána prevalence patogenů, přičemž bylo pozorováno výrazné zvýšení prevalence Nosema ceranae ve včelstvech na jaře oproti podzimnímu období, a naopak výrazné snížení prevalence Lotmaria passim a Serratia marcescens. V podzimních odběrech ze včelstev byla také pozorována daleko větší diverzita ve výskytu patogenů. Výsledky práce poskytují nová data o prevalenci patogenů a jejich sezónním výskytu v České republice. Dále byla optimalizována metoda LAMP v kombinaci s FTA kartami pro detekci N. ceranae. Složení reakční směsi a množství přidávaného detekčního barviva bylo upraveno pro optimální průběh reakce a snadné určení pozitivního výsledku. Byly ale pozorovány falešně pozitivní výsledky způsobené nespecifickou amplifikací či kontaminací. Pro zavedení metody je tedy potřeba dalších optimalizačních kroků.

Abstract:

Honey bee pathogens belong to a group of factors that have a negative impact on bee health. Screening of honey bee pathogens is important for early recognition of infection, the spread of which can then be easily avoided. The most used method for honey bee pathogen detection is PCR. However, its disadvantages include high cost of equipment, sensitivity to contaminants and the need for thermal cycling. Isolation of DNA prior to PCR is also rather costly when commercial DNA-isolating kits are used. A cheaper and less time-consuming alternative to DNA isolation could be FTA cards, which allow for long-term storage of DNA at room temperature. An alternative to PCR itself could be loop-mediated isothermal amplification (LAMP), which is a method allowing fast DNA amplification under isothermal conditions. In the experimental part, the use of FTA cards was optimised for the storage of honey bee homogenates and their subsequent processing for PCR applications. FTA cards were used alongside with DNA-isolating kit DNeasy Plant Mini kit for the detection of five selected pathogens in honey bee samples from autumn and spring. FTA cards were evaluated as a cheaper and faster alternative to commercial isolation kits. Next, the prevalence of pathogens was determined. A significant increase in the prevalence of Nosema ceranae was observed in spring samples compared to autumn samples. Conversely, a significant decrease in the prevalence of Lotmaria passim and Serratia marcescens was observed in spring samples. Much greater diversity in the occurrence of pathogens was also observed in autumn bee colonies. The results of this thesis provide new data on the prevalence of pathogens and their seasonal occurrence in the Czech Republic. Furthermore, the LAMP method was optimised in combination with FTA cards for the detection of N. ceranae. The composition of the reaction mixture and the amount of added dye for detection were adjusted for optimal reaction and easy determination of a positive result. However, false positive results caused by either contamination or nonspecific amplification were observed. Therefore, further optimisation steps are needed in order to routinely use this method.

Keywords

včelí patogeny, detekce patogenů, PCR, LAMP, FTA karty, Nosema spp., Lotmaria passim, Serratia marcescens, Crithidia mellificae

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2023

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry