Funkce oxidu dusnatého v rámci epiteliální imunity včely medonosné

Bc. Linda TÖLGOVÁ

Diplomová práce

The function of nitric oxide in the epithelial component of the honey bee immunity

Anotace:

Střevní epitel poskytuje první obrannou linii proti orálně přijatým patogenům. Epiteliální imunitu tvoří symbiotický střevní mikrobiom a epiteliální buňky, které primárně zajišťují celistvost trávicího traktu, ale také mohou zprostředkovat produkci molekul podílejících se na imunitních odpovědích jako jsou antimikrobiální peptidy, reaktivní formy kyslíku a oxid dusnatý (NO). NO, který je v buňkách primárně produkován NOsynthasou, je malá nenabitá molekula, která snadno difunduje přes buněčné membrány, což se odráží mimo jiné i na jeho funkci v imunitním systému bezobratlých. NO působí jako signální a cytotoxická molekula, a to dle jeho koncentrace v buňce. Duální charakter NO je klíčový pro imunitní systém bezobratlých, přičemž NO může tvořit reaktivní metabolity, jako je např. peroxydusitan, které mohou likvidovat patogeny přímo, nebo může jako signální molekula stimulovat produkci efektorových molekul např. antimikrobiálních peptidů. V experimentální části bylo studováno zapojení NO do produkce antimikrobiálních peptidů, konkrétně abaecinu, defensinu-1 a hymenoptaecinu, v trávicím traktu včel krmených kompetitivním inhibitorem NOsynthasy N-nitro-L-argininmethylesterem, čímž byla negativně ovlivněna produkce NO. Nejprve byla provedena analýza genové exprese abaecinu, defensinu-1 a hymenoptaecinu pomocí metody qPCR, přičemž bylo po stimulaci imunitního systému včel bakteriálními lipopolysacharidy pozorováno snížení relativní exprese studovaných genů u včel s potravou obohacenou o N nitro L argininmethylester. Produkce abaecinu, defensinu-1 a hymenoptaecinu byla analyzována imunohistochemicky v příčných řezech žaludku včel. U skupiny včel, která byla krmena N nitro L argininmethylesterem, byla opět po stimulaci imunitního systému bakteriálními lipopolysacharidy detekována nižší produkce antimikrobiálních peptidů, avšak tyto rozdíly byly signifikantní pouze u defensinu 1. Dále byly stanoveny hladiny studovaných antimikrobiálních peptidů v celém trávicím traktu včel imunochemicky metodou ELISA, přičemž u včel krmených N-nitro-L-argininmethylesterem a lipopolysacharidy byly pozorovány zvýšené hladiny antimikrobiálních peptidů. Analýza genové exprese a imunohistochemická detekce antimikrobiálních peptidů u včel krmených inhibitorem NOsynthasy poskytují prvotní důkazy o negativní regulaci produkce antimikrobiálních peptidů prostřednictvím snížených hladin NO u Apis mellifera. Ačkoliv metoda ELISA tuto hypotézu nepotvrzuje, vyšší hladiny antimikrobiálních peptidů u včel krmených N nitro L-argininmethylesterem by mohly být vysvětleny přítomností zásobáren s antimikrobiálními peptidy, ze kterých byly antimikrobiální peptidy při přípravě vzorku uvolněny a následně imunochemicky detekovány. Tato pilotní studie tak přináší prvotní výsledky podporující významnou funkci NO v rámci epiteliální složky imunity včel, jak bylo demonstrováno inhibicí produkce NO, v jejímž důsledku byla negativně ovlivněna genová exprese a produkce antimikrobiálních peptidů u A. mellifera.

Abstract:

The intestinal epithelium is the first line of defence against orally ingested pathogens. Epithelial immunity consists of the symbiotic gut microbiome and epithelial cells, which primarily ensure the integrity of the gastrointestinal tract but may also mediate the production of molecules involved in immune responses, such as antimicrobial peptides, reactive oxygen species and nitric oxide (NO). NO, primarily produced in cells by NO synthase, is a small uncharged molecule that readily diffuses across cell membranes, which is reflected in its function in the invertebrate immune system, among other things. NO acts as a signalling and cytotoxic molecule, depending on its concentration in the cell. The dual nature of NO is crucial for the invertebrate immune system, whereby NO can form reactive metabolites, such as peroxynitrite, which can kill pathogens directly, or it can stimulate the production of effector molecules, such as antimicrobial peptides, as a signaling molecule. In the experimental part, the involvement of NO in the production of antimicrobial peptides, namely abaecin, defensin-1, and hymenoptaecin, was studied in the digestive tract of bees fed with the competitive inhibitor of NOsynthase N-nitro-L-arginine methyl ester, thereby negatively affecting NO production. First, the gene expression of abaecin, defensin-1 and hymenoptaecin was analyzed by qPCR and a decrease in the relative expression of the studied genes was observed after stimulation of the bee immune system with bacterial lipopolysaccharides in bees fed with a diet enriched with N nitro L arginine methyl ester. The production of abaecin, defensin-1 and hymenoptaecin was analyzed by immunohistochemistry in transverse sections of the stomach of bees. In the group of bees fed with N-nitro-L-arginine methyl ester, lower production of antimicrobial peptides was again detected after stimulation of the immune system with bacterial lipopolysaccharides. Although, these differences were significant only for defensin-1. Furthermore, the levels of the studied antimicrobial peptides were determined in the whole digestive tract of bees by immunochemical ELISA. Increased levels of antimicrobial peptides were observed in bees fed with N-nitro-L-arginine methyl ester and lipopolysaccharides. Gene expression analysis and immunohistochemical detection of antimicrobial peptides in bees fed with the NOsynthase inhibitor provide initial evidence for negative regulation of antimicrobial peptide production via reduced NO levels in Apis mellifera. Although the ELISA method does not support this hypothesis, the higher levels of antimicrobial peptides in bees fed with N-nitro-L-arginine methyl ester could be explained by the presence of antimicrobial peptide reservoirs from which antimicrobial peptides were released during sample preparation and subsequently detected immunochemically. This pilot study thus provides initial results supporting an important function of NO within the epithelial component of honey bee immunity, as demonstrated by the inhibition of NO production resulting in a negative effect on gene expression and antimicrobial peptide production in A. mellifera.

Klíčová slova

epiteliální imunita, oxid dusnatý, antimikrobiální peptidy, abaecin, defensin-1, hymenoptaecin, včela medonosná

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 4. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Martina Janků, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie