Enzymy biosyntézy a metabolismu reaktivních forem dusíku v imunitních odpovědích včel

Bc. Jakub KUBNÝ

Diplomová práce

Enzymes of biosynthesis and metabolism of reactive nitrogen species in honey bee immune responses

Anotace:

V teoretické části diplomové práce jsou shrnuty současné znalosti o funkci oxidu dusnatého (NO) a reaktivních forem dusíku (RNS) ve včelím metabolismu a imunitním systému. Jsou popsány enzymové i neenzymové mechanismy vzniku NO, jeho přímé reakce a reakce RNS. Popsány jsou rovněž interakce NO se signálními dráhami, které vedou k syntéze antimikrobiálních peptidů (AMPs) u hmyzu a včel. V teoretického části práce jsou také popsány biochemické a molekulárně biologické metody analýzy enzymů NO synthasy (NOS; EC 1.14.13.39) a S-nitrosoglutathionreduktasy (GSNOR; EC 1.1.1.284). Experimentální část byla zaměřená na zavedení metod analýzy genové exprese a enzymové aktivity NOS a GSNOR ve vzorcích včely medonosné (Apis mellifera carnica). Byly stanoveny kinetické parametry včelí NOS a GSNOR a inhibice enzymů vybranými inhibitory. Metodou qPCR byla stanovena exprese genů NOS, GSNOR, ESTERASY JUVENILNÍHO HORMONU (JHE) a VITELLOGENINU. Exprese byla měřena u larev vystavených různým dávkám spor Paenibacillus larvae a u včel infikovaných směsnou kulturou bakterií P. larvae a Escherichia. coli. U včel i larev bylo pozorováno zvýšení aktivity NOS a GSNOR v odpovědi na patogeny. Exprese NOS a GSNOR byla zvýšena v odpovědi na patogeny pouze u včelích larev. U larev nebyla hladina exprese JHE závislá na počtu spor P. larvae a VITELLOGENIN nebyl exprimován, zatímco u dospělých včel byla exprese JHE a VITELLOGENINU snížena. Hladiny S-nitrosothiolů (RSNOs) u včel nebyly použitými metodami detekovány. Výsledky této práce přinášejí první ucelený pohled na molekulární úrovni na zapojení těchto genů a enzymů u včel.

Abstract:

The theoretical part summarizes information concerning the function of nitric oxide (NO) and reactive nitrogen species (RNS) in metabolism and the immune system of honey bee. The enzymatic and non-enzymatic mechanisms of NO formation, its reactions and RNS interactions are described. NO interactions with signaling pathways that lead to the synthesis of antimicrobial peptides (AMPs) are also described. Finally, biochemical and molecular biology methods of NO synthase (NOS; EC 1.14.13.39) and S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR; EC 1.1.1.284) analysis are described. The experimental part was focused to introduction of methods of gene expression analysis and enzyme activity of NOS and GSNOR in honey bee samples (Apis mellifera carnica). Kinetic parameters of bees NOS and GSNOR and enzyme inhibition by selected inhibitors were determined. The expression of NOS, GSNOR, JUVENILE HORMONE ESTERASE (JHE) and VITELLOGENIN genes was determined by qPCR. Gene expression was measured in bee larvae exposed to various doses of spores of Paenibacillus larvae and in bees infected with a mixed culture of P. larvae and Escherichia coli. Increased NOS and GSNOR activities were observed in bees and larvae in response to pathogens. Expression of NOS and GSNOR genes was increased in response to pathogens only in bee larvae. In larvae, JHE expression levels were not dependent on doses of P. larvae spores and VITELLOGENIN was not expressed at all, whereas in adult bees the expression of JHE and VITELLOGENIN was reduced. S-nitrosothiols (RSNOs) levels were not detected by the used methods. These results bring the first comprehensive view of the involvement of these genes and enzymes in bees at the molecular level.

Klíčová slova

Apis mellifera, imunitní systém hmyzu, NO synthasa, oxid dusnatý, Paenibacillus larvae, S-nitrosoglutathionreduktasa, včela medonosná

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 27. 5. 2019
• Vedoucí: prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie