Vývoj a validace multiplexní technologie xMAP pro detekci a kvantifikaci patogenních virů v prostředí.

Mgr. Jakub Hrdý, Ph.D.

Doctoral thesis

Development and validation of multiplex xMAP technology for detection and quantification of pathogenic viruses in the environment

Abstract:

Se stále postupujícím technologickým vývojem a rozvojem moderní společnosti narůstají i požadavky na zajištění dostatečného množství kvalitních a bezpečných potravin, vodních zdrojů a celkové bezpečnosti prostředí, ve kterém žijeme. I přes dostupné pokročilé technologie stále existují určitá rizika, která se pojí s jejich potenciální kontaminací patogenními agens. Přispívají k tomu procesy globalizace a i v současnosti populární trend konzumace čerstvých a minimálně opracovaných potravin. V případě prostředí budou v budoucnosti navíc hrát stále podstatnější roli i probíhající klimatické změny. Po dlouhou dobu byla věnována pozornost především bakteriálním patogenům. Tento přístup se však rychle mění a větší pozornost se obrací i na viry a parazity, jakožto významná agens, jejichž socioekonomický dopad a dopad na zdraví populace může být značný. Aby bylo možné monitorovat výskyt kontaminací a včasně identifikovat původce v případě vypuknutí epidemií, je zapotřebí mít dostupné spolehlivé nástroje detekce. Ty musí splňovat požadavky dostatečné citlivosti a specifity. Tato práce se zabývá problematikou detekce virových agens ze vzorků potravin, vod a prostředí. Zlatým standardem detekce virových částic (resp. specifických oblastí jejich genomu) jsou v současnosti metody polymerázové řetězové reakce probíhající v reálném čase. Na pracovišti Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, v.v.i. jsou zavedeny a využívány pro detekci virových agens v humánních a zvířecích vzorcích nebo ve vzorcích potravin, vod či prostředí. V kombinaci s metodami pro prvotní zpracování vzorků, které většinou musí být cíleny přímo na konkrétní matrice, byly využity pro zisk dat, díky kterým vznikla řada publikací, které jsou součástí této práce. Používané metody polymerázové reakce probíhající v reálném čase mají však také své limitace. Jednou z nejvýraznějších je omezená možnost vytvářet robustnější multiplexní systémy. Pro identifikaci vícera patogenů je tak zapotřebí použití několika individuálních systémů. Cílem této práce proto bylo vyvinout a validovat metodu využívající multiplexní oligonukleotidovou ligaci s polymerázovou řetězovou reakcí v kombinaci s technologií xMAP, a tak překonat omezení současných metod. V rámci vývoje vzniklo několik aplikovaných výsledků zaměřených na detekci nejen virových patogenů. Byla zavedena a mezilaboratorními testy i ověřena robustní metoda detekce s dostatečnou specifitou a citlivostí, která má potenciál stát se spolehlivým rutinním nástrojem pro monitoring a kontrolu bezpečnosti potravin a prostředí.

Abstract:

With the ever-advancing technological progress and the development of modern society, the requirement to ensure sufficient amount of quality and safe food, water resources and the overall safety of the environment in which we live is also growing. Despite the available advanced technologies, there are still certain risks associated with their potential contamination with pathogenic agents. The processes of globalization and the currently popular trend of consuming fresh and minimally processed food contribute to this issue. In the case of the environment, ongoing climate changes will also play an increasingly important role in the future. For a long time, attention was paid mainly to bacterial pathogens. However, this approach is changing rapidly and more attention is being paid to viruses and parasites, as important agents whose socio-economic and health impact on the population can be considerably significant. Reliable detection tools are needed to monitor the incidence of contamination and to identify the cause of epidemics in a timely manner. These must meet the requirements of sufficient sensitivity and specificity. This thesis deals with the detection of viral agents from food, water and environmental samples. Real-time polymerase chain reaction methods are currently the “gold standard” for virus particle (i.e. specific regions of their genome) detection. These methods are established and used in the laboratories of the Veterinary Research Institute, v.v.i. for the detection of viral agents in human, animal, food, water or environmental samples. Together with the methods for the initial processing of samples, which usually have to be targeted at specific matrices, they were used to obtain data, which resulted in a number of publications that are part of this dissertation. However, the real-time polymerase reaction methods also have their limitations. One of the most significant is the limited ability to create more robust multiplex systems. Hence, the use of several individual systems is required to identify multiple pathogens. The main aim of this thesis was to develop and validate a method using multiplex oligonucleotide ligation with polymerase chain reaction in combination with xMAP technology, and thus overcome the limitations of current methods. During the development, several applied results focused on the detection of not only viral pathogens were created. A robust detection technique with sufficient specificity and sensitivity has been introduced and verified by inter-laboratory tests, this method has the potential to become a reliable routine tool for monitoring and control of food and environmental safety.

Keywords

virus, izolace nukleových kyselin, detekce, multiplexní, xMAP, viry kontaminující potraviny, viry kontaminující vodní zdroje, isolation of nucleic acids, detection, multiplex, foodborne viruses, waterborne viruses

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 3. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 8. 4. 2022
• Supervisor: Mgr. Petra Vašíčková, Ph.D.
• Reader: doc. MVDr. Josef Kameník, CSc., RNDr. Marianna Cíchová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Microbiology / Microbiology