Využití CRISPR/Cas9 systému k přípravě buněčného modelu cystické fibrózy pro vysokokapacitní testování látek

Bc. Lukáš LENART

Master's thesis

CRISPR/Cas9 as a tool for the development of a cystic fibrosis model for high throughput screening of compounds

Abstract:

Cystická fibróza je závažným dědičným onemocněním, jež je podmíněno mutacemi genu cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Expresí tohoto genu vzniká stejnojmenný membránový protein představující iontový kanál pro transport chloridových a bikarbonátových iontů. Mutace CFTR jsou spjaty s narušením buněčné lokalizace či funkce CFTR, v některých případech však dochází k absolutní ztrátě tohoto proteinu. Důsledkem je pak rozvrat transportu iontů, negativně ovlivňující funkci mnoha orgánových soustav. Současná léčba cystické fibrózy vychází z použití léčiv, tzv. modulátorů, jež umožňují obnovení funkce mutantního CFTR. Vývoj těchto modulátorů je komplikován velkou variabilitou molekulárních mechanismů, jimiž jednotlivé typy mutací ovlivňují CFTR. Většina dnes používaných modulátorů byla vyvinuta ze sloučenin identifikovaných vysokokapacitním testováním chemických knihoven za využití buněčných modelů cystické fibrózy. Tyto buněčné modely jsou založeny na exogenní expresi mutantního CFTR, která nemusí vždy věrně reprezentovat fyziologické podmínky, či umožnit zachycení podstaty jistých typů mutací CFTR. Z tohoto důvodu je žádoucí příprava buněčných modelů cystické fibrózy s endogenní expresí mutantního CFTR, jež by byly vhodné pro vysokokapacitní testování látek za účelem identifikace nových efektivnějších modulátorů. Náplní této diplomové práce byla validace dvou reportérových linií umožňujících detekci endogenních hladin WT-CFTR značeného HiBiT tagem, následovaná designem a validací CRISPR/Cas9 systému pro inzerci nejfrekventovanější mutace CFTR - F508 do příslušného genomického lokusu. V samotném závěru práce byla jedna z validovaných reportérových linií exprimující WT-CFTR značený HiBiT tagem modifikována pomocí CRISPR/Cas9 systému, optimalizovaného pro co nejvyšší možnou efektivitu inzerce F508 do genu CFTR.

Abstract:

Cystic fibrosis is a severe autosomal recessive disorder, caused by mutations of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene (CFTR). This gene encodes an ion channel of the same name, that transports chloride and bicarbonate ions across the cell membrane. Most of the CFTR mutations are associated with hindered cellular localization or function of the CFTR, yet some of them lead to an absolute loss of the protein. As a result, ion transport is compromised, which negatively affects numerous organ systems. Currently, cystic fibrosis treatment relies on a specific class of therapeutics - modulators, that can restore the function of the mutant CFTR. However, the development of these modulators is complicated by the vast variability of molecular mechanisms, by which the different types of mutations affect the CFTR. The majority of the modulators that are clinically used have been developed from compounds that were identified by high throughput screening of chemical libraries utilizing cellular models of cystic fibrosis. As these models rely on the exogenous expression of mutant CFTR, they might not faithfully represent the physiological cellular conditions, or they fail to capture molecular aspects of certain types of mutations. Thereby, the development of cystic fibrosis cellular models endogenously expressing mutant CFTR, that can be used to identify novel, more efficient modulators by the means of high throughput screening is desirable. The first subject of this master thesis was the validation of two reporter cell lines that enable the detection of endogenous levels of WT-CFTR tagged with HiBiT tag. The second subject was focused on the design and validation of the CRISPR/Cas9 system for the genomic insertion of the most frequent CFTR mutation - F508. Finally, one of the validated cell lines endogenously expressing WT-CFTR with HiBiT tag was modified by the CRISPR/Cas9 system that was optimized for the highest possible effectivity of F508 genomic insertion.

Keywords

Cystická fibróza, CFTR, vysokokapacitní testování látek, CRISPR/Cas9

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2023

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Martin Ondra

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Molecular and Cell Biology / Molecular and Cell Biology