<p>Modulace nádorové imunitní odpovědi <em>in vitro</em>: Vliv buněčné konfluence na expresi PD-L1 a dalších regulačních molekul</p>

Bc. Pavel Müller

Diplomová práce

<p>Modulation of tumor immune response <em>in vitro</em>: The impact of cell confluence on PD-L1 expression and other regulatory molecules</p>

Anotace:

Únik imunitní destrukci je jedním ze základních znaků nádorového bujení. Zásadní roli zde má interakce PD-L1/PD-1. Zvýšená exprese ligandu PD-L1 na povrchu nádorových buněk se váže na receptor PD-1 T‑lymfocytů a tlumí jejich cytotoxickou aktivitu. Blokáda této interakce pomocí inhibitorů imunitních checkpointů představuje terapeutickou strategii s příznivějším profilem nežádoucích účinků než konvenční chemoterapie či radioterapie. Exprese PD‑L1 je dynamicky regulována signály z nádorového mikroprostředí. In vitro experimenty, nepostradatelné pro studium těchto regulačních drah, však často opomíjejí vliv hustoty buněčné populace (konfluence). Změny v konfluenci přitom mohou nezávisle na testovaných látkách spouštět hypoxii, metabolický stres a alterovat signální dráhy, což může maskovat či zkreslovat účinky léčiv. Do této regulace vstupuje také nádorový supresor p53, který podle kontextu dokáže expresi imunitních modulátorů zesilovat i potlačovat, a zásadně tak ovlivňovat imunogenicitu nádorů. Souhra mezi stresem vyvolaným konfluencí a statusem p53 může být důležitým faktorem pro expresi nejen PD-L1. Práce popisuje, jak konfluence ovlivňuje expresi PD‑L1, a dalších povrchových proteinů řídících interakce mezi nádorovými a imunitními buňkami. Pomocí lidských nádorových linií s odlišným statusem p53 byla sledována exprese PD‑L1, MHC I, CD166 a dalších markerů v závislosti na hustotě kultury. Výsledky ukázaly, že exprese PD‑L1, MHC I a CD166 s rostoucí konfluencí klesá, přičemž funkční p53 zajišťuje citlivější odezvu. Vysoká konfluence zároveň navozuje rezistenci vůči cisplatině i roskovitinu. Byl odhalen potenciál význam inhibice CDK5, kdy roskovitin zvyšuje expresi MHC I nezávisle na statusu p53, a působí selektivní narůst PD‑L1 u p53null buněk, což odráží kontextově specifickou roli CDK5 a protektivní funkci p53. Přechod ke 3D sféroidním kulturám zesílil fenotypické rozdíly mezi liniemi v morfologii, růstu i expresi PD‑L1 a potvrdil vyšší citlivost 3D modelů. Práce zdůraz-ňuje nezbytnost standardizace buněčné hustoty v in vitro experimentech, motivuje k širšímu využití 3D kultur a prohlubuje porozumění dynamické regulaci nádorového imunitního úniku, což může přispět k přesnějšímu preklinickému testování imunomodulačních látek.

Abstract:

Evasion of immune destruction is a key hallmark of cancer. Crucial in this process is the PD-L1/PD-1 interaction. Elevated expression of the PD-L1 ligand on tumor cells engages the PD-1 receptor on T‑lymphocytes and dampens their cytotoxic activity. Blockade of this interaction using immune checkpoint inhibitors is a therapeutic strategy with a more favorable adverse effect profile than conventional chemotherapy or radiotherapy. PD-L1 expression is dynamically regulated by signals from the microenvironment. In vitro experiments, used to study these pathways, often neglect the influence of cell population density (confluence). Yet changes in confluence can trigger hypoxia, metabolic stress and alter signaling pathways, which may mask or distort the effects of tested substances. The tumor suppressor p53 also enters this regulatory network. Depending on context, it can either enhance or suppress the expression of immune modulators, thereby affecting tumor immunogenicity. The interplay between confluence‑induced stress and p53 status may be critical for the expression not only of PD-L1. The work describes how confluence influences the expression of PD‑L1 and other molecules that govern interactions between tumor and immune cells. Using human tumor cell lines with different p53 status, we monitored the expression of PD‑L1, MHC I, CD166 and other markers in relation to culture density. The results showed that PD‑L1, MHC I and CD166 expression decreases with increasing confluence, with functional p53 mediating a more sensitive response. High confluence also induced resistance to both cisplatin and roscovitine. A significant translational potential of CDK5 inhibition was revealed: roscovitine increases MHC I expression independently of p53 status and causes a selective increase of PD‑L1 in p53‑null cells, reflecting the context‑specific role of CDK5 and the protective function of p53. The transition to 3D spheroid cultures amplified differences between the lines in morphology, growth and PD‑L1 expression, confirming the higher sensitivity of 3D models. The work underscores the necessity of standardized cell density for in vitro experiments, motivates broader use of 3D cultures, and deepens the understanding of tumor immune evasion, which may contribute to more accurate testing of immunomodulatory agents.

Klíčová slova

nádorový imunitní únik, PD-L1, imunitní checkpointy, buněčné kultury, konfluence, p53, MHC I, CD166, roskovitin, cisplatina, 3D sféroidy, tumor immune escape, immune checkpoints, cell cultures, confluence, roscovitine, cisplatin, 3D spheroids

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2026

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 6. 2026
• Vedoucí: Mgr. Pavlína Zatloukalová, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Marta Nekulová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie