Příprava konjugátů kyseliny borité s vybranými enzymy a jejich použití v klinické diagnostice

Bc. Jiří Andrejs

Diplomová práce

Preparation and use of enzyme-boronic acid conjugates

Anotace:

Hlavního cíle této práce, tedy vytvoření stabilního konjugátu kyseliny 3 (brommethyl) fenylborité (BrPBA) a Křenové peroxidázy (HRP) za pomoci můstku z bovinního sérového albuminu (BSA) bylo dosaženo. Lze konstatovat, že výroba takového konjugátu není příliš náročná. Pro ověření konjugace byly použity spektrofotometrické metody a hmotnostní spektroskopie. Průměrný počet molekul kyseliny 3-(brommethyl) fenyl borité navázaných na můstku z bovinního sérového albuminu byl 18. Jako stanovovaný analyt sloužil glykovaný bovinní sérový albumin a průměrný počet navázaných molekul sacharidu bylo také 18. Dalším cílem bylo ověření funkčnosti konjugátu a jeho afinity vůči diolovým strukturám a k tomu byla použita modifikovaná verze metody ELISA a spektrofotometrická metoda s Alizarinem Red S. Tohoto cíle bylo dosaženo pouze částečně. Během ověřování se ukázalo, že konjugát je schopen reagovat nejen pomocí borité skupiny s dioly, ale i dalšími nespecifickými interakcemi. K eliminování těchto nespecifických interakcí došlo však jen částečně pomocí přídavku bovinního sérového albuminu. Zároveň se také během testování afinitní reakce ukázalo, že afinita konjugátu k diolovým strukturám je pravděpodobně mnohem větší než u kyseliny borité. Lze tedy konstatovat, že pokud dojde k eliminaci, či výraznějšímu omezení nespecifických interakcí konjugátu, mohl by se takovýto konjugát stát alternativou k protilátkám v metodách stanovující látky s diolovou strukturou.

Abstract:

The main goal of this thesis the successful conjugation of 3-(bromomethyl) phenylboronic acid and Horse radish peroxidase through linking with bovine serum albumin was achieved. The process of making this conjugate is not too demanding. For the verification of successful conjugation were used spectrofotometric methods and mass spectroscopy. The average number of successfully conjugated molecules of 3-(bromomethyl) phenylboronic acid with bovine serum albumin linker was 18. The glycated bovine serum albumin was prepared as a target for affinity testing. The average number of saccharides molecules on bovine serum albumin was 18. The secondary goal the testing the affinity interaction of this conjugate was achieved only partially. For affinity testing was used modified ELISA method and spectrofotometric method with Alizarin Red S. During the testing had been shown that the interaction between the conjugate and diols was not the only interaction the conjugate is capable of. The elimination of this nonspecific interaction was achieved only partially by adding bovine serum albumin. During the testing was also shown that the affinity interaction between conjugate and diols is probably greater than affinity interaction between boronic acid and diols. The conjugate could be alternative to antibodies in methods using to determine molecules with diol structure if the elimination or at least greater limitations of nonspecific interaction was achieved.

Klíčová slova

konjugát, křenová peroxidáza, HRP, kyselina boritá, boronic acid, dioly, stanovení diolů, ELISA, Alizarin Red S.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 1. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 2. 2012
• Vedoucí: Mgr. Jan Přibyl, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie