Metallochelating nanoliposomes for construction of recombinant vaccines

PharmDr. Bc. Josef Mašek, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Liposomy představují nosiče vakcín, které vykazují adjuvantní aktivitu k neseným proteinovým antigenům. Metalochelatační liposomy jsou navrženy pro vazbu His-tagovaných proteinů nekovalentní interakcí. Tyto liposomy byly připraveny ze směsi fosfatidylcholinu a metalochelatačního lipidu DOGS-NTA-Ni metodou odstranění detergentu a metodou hydratace lipidního filmu s následnou extruzí. Jako molekulární adjuvans se do liposomů inkorporovaly nepyrogenní lipofilní deriváty muramyl dipeptidu. Na povrch liposomů byly navázány metalochelatační vazbou His-tagované rekombinantní proteiny GFP, Gp120, OspC a Hsp90. Struktura proteoliposomů byla studována metodami dynamického rozptylu světla, transmisní elektronové mikroskopie, mikroskopie atomárních sil a gelové permeační chromatografie. Liposomy s lipofilními deriváty muramyl dipeptidu orientovanými na povrch liposomu byly rozpoznávány a fagocytovány lidskými dendritickými buňkami v in vitro experimentech. In vivo zmíněná experimentální vakcína aplikovaná myším intradermální cestou navodila Th1 i Th2 typ imunitní odpovědi. Po jejím podání nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky. Metalochelatační liposomy v kombinaci s lipofilními deriváty muramyl dipeptidu představují novou biokompatibilní platformu pro konstrukci experimentálních rekombinantních vakcín. V první části dizertační práce jsou zmíněny hlavní aspekty rekombinantních vakcín. Stručně jsou popsány liposomální a neliposomální nosiče rekombinantních vakcín o velikosti v řádu nanometrů a mikrometrů. Dále jsou popsány metody vazby antigenů na liposomální nosiče. Zvláštní pozornost je věnována metalochelatační vazbě proteinů a nosičům vakcín založených na metalochelatační vazbě. První část práce je také věnována mechanismu účinku liposomálních vakcín a způsobům jejich podání. V části Materiály a metody jsou popsány vybrané metody pro přípravu a charakterizaci proteoliposomů. Část Výsledky a diskuze sumarizuje nejdůležitější výstupy z tří přiložených vědeckých publikací. V těchto pracích jsou metody a výsledky popsány a diskutovány podrobně. Přiložená kapitola v knize přehledně shrnuje poznatky v oblasti metalochelatačních liposomů a jejich roli jako nosičů vakcín.

Abstract:

Liposomes represent nanoscale-based formulations showing a potent adjuvant activity to protein antigens. Metallochelating liposomes were designed to attach His-tagged protein by non-covalent interaction. Metallochelating liposomes were prepared from the mixture of egg phosphatidyl choline and nickel-chelating lipid DOGS-NTA-Ni by the detergent-removal method and by hydration of a lipid film followed by extrusion. New non-pyrogenic hydrophobized derivatives of muramyl dipeptide were incorporated into liposomes as molecular adjuvants. His-tagged recombinant GFP, Gp120, OspC and Hsp90 were attached onto the surface of liposomes by metallochelating bond. The structure of proteoliposomes was studied by dynamic light scattering, transmission electron microscopy, atomic force microscopy, and gel permeation chromatography. The liposomes with surface-exposed hydrophobized derivatives of muramyl dipeptide were well recognized and phagocyted by human dendritic cells in vitro. In vivo, the immune response towards this experimental vaccine applied in mice by intradermal route demonstrated both Th1 and Th2 response. No side effects were observed after the application of liposomes. Metallochelating liposomes with lipophilic derivatives of muramyl dipeptide represent a new biocompatible platform for the construction of experimental recombinant vaccine. In the first part of the Thesis, main aspects of recombinant vaccines are addressed. Nano- and microscaled non-liposomal and liposomal vaccine delivery systems as well as the methods used for the attachment of antigens to liposomes are briefly described. Special attention is paid to the metallochelation bond and vaccine delivery systems based on the approach of metallochelation. This part also describes the mechanism of action and routes of application of liposomal vaccine delivery systems. In the section Material and Methods, the most relevant methods for the preparation and characterization of proteoliposomes are introduced. The section Results and Discussion summarizes the most important outcomes from the three attached original research articles. In these attached publications, the applied methods as well as all the obtained results are described and discussed in detail. The attached book chapter gives an overview of the field of metallochelating liposomes and their role in vaccine delivery.

Keywords

liposome, metallochelating lipid, recombinant vaccine, His-tag, molecular adjuvant

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2013
• Supervisor: doc. RNDr. Jaroslav Turánek, CSc.
• Reader: doc. PharmDr. Kateřina Dvořáčková, PhD., prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry