Klonování a charakterizace glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasy

Bc. Lucia Slepánková

Diplomová práce

Cloning and characterisation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Anotace:

Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa je známý enzym, který má svoji nezastupitelnou roli v metabolismu buňky. Tento glykolytický enzym má však mnohé další funkce. Nedávné studie potvrzují, že se GAPDH účastní procesu oprav DNA, apoptotické kaskády nebo je dávána do souvislosti s rakovinou prostaty. Tato práce je zaměřena spíše na její vazebné vlastnosti. GAPDH z bakterie Lactobacillus plantarum má totiž vlastnost lektinu, váže sacharidové struktury krevních antigenů. Byly nalezeny i další mikroorganismy, které GAPDH využívají jako adhezivní molekulu, která se váže na množství glykoproteinů (plasminogen, fibronektin, mucin atp.). Jedním z nich je kvasinka Candida albicans. Tento podmíněný patogen je hrozbou pro imunodeficientní pacienty. GAPDH nalezená na povrchu její buněčné stěny se váže na glykoproteiny hostitelského organismu. GAPDH z Candida albicans a Lactobacillus plantarum se svým proteinovým uspořádáním téměř neliší a je tedy otázkou, zda má kvasinkový enzym taktéž lektinové vlastnosti. Jejich zkoumání je důležité pro přípravu anti-adhezivních léčiv, která v současné době, kdy přestávají být antibiotika účinná díky rezistentním kmenům, nabývají na významu. Praktická část práce si kladla za cíl vytvoření takového metodického postupu práce, aby bylo možné ověřit lektinovu aktivitu potenciálního lektinu. Byly využity klasické metody, hemaglutinace, vsádková metoda a metody moderní SPR a ITC. Tato metodika byla následně využita pro analýzu potenciálních lektinových vlastností komerčních GAPDH ze Saccharomyces cerevisiae a králičího svalu. S využitými sacharidy se však lektinová aktivita nepotvrdila. Pomocí technik molekulární biologie byla vytvořena rekombinantní molekula nesoucí gen pro GAPDH z Canadida albicans. Rekombinantní molekula je připravena pro transformaci do expresních buněk a následnou expresi a purifikaci tohoto proteinu. Díky vytvořené metodice pro analýzu lektinových vlastností se takto vypurifikovaný protein bude moci dále testovat.

Abstract:

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase enzyme is known for an essential role in cell metabolism. However this glycolytic enzyme but has many other functions. Recent studies confirm that GAPDH participates in the process of DNA repair or apoptosis cascade. It is also probably associated with prostate cancer development. This work is focused more on its binding properties. GAPDH from the bacterium Lactobacillus plantarum has a lectin characteristic, binds to carbohydrate structures of blood antigens. GAPDH is used as an adhesive molecule that binds to a number of glycoproteins (plasminogen, fibronectin, mucin, etc.) also in other micro-organisms. One of them is Candida albicans. This opportunistic pathogen is a threat to immunodeficient patients. GAPDH on the surface of its cell wall binds to glykoproteins of a host organism. GAPDH from Candida albicans and Lactobacillus plantarum possesses nearly identical protein sequence and is therefore questionable whether the yeast one has also lectin properties. Their study could leads to preparation of new anti-adhesion drugs, especially nowadays, when antibiotics cease to be effective due to evolvement of resistant strains.. The goal of practical part of this thesis is development of a methodology for verification of the potential lectin activity. Classical methods (hemagglutination, affinity method with immobilized saccharides) as well as modern methods (SPR and ITC) were used. This methodology was subsequently used for the analysis of potential lectin properties of commercial GAPDHs from Saccharomyces cerevisiae and rabbit muscle. However, no lectin activity was detected considering used saccharides. Recombinant molecules carrying a gene for GAPDH from Candida albicans was prepared using molecular biology techniques. Recombinant molecules are ready to be transformed into express cells for subsequent expression and purification. This protein could be further tested by approved and optimized methods.

Klíčová slova

glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa, adheze, lektin, Candida albicans, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, adhesion, lectin

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2011
• Vedoucí: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie