Využití DNA čipů a profilování mikroRNA ve výzkumu nádorů tlustého střeva a konečníku

RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

Doctoral thesis

Usage of DNA microarrays and microRNA profiling in the colorectal cancer research

Abstract:

Studie A Východiska: Kolorektální karcinom (CRC) je jedním z nejvíce frekventovaných nádorových onemocnění na světě. Metastatické postižení regionálních lymfatických uzlin je důležitým prognostickým faktorem z hlediska progrese onemocnění i terapeutického přístupu k pacientovi. Předpokládáme, že analýza profilů genové exprese pacientů s CRC pomocí nízko-hustotních oligonukleotidových čipů nám umožní identifikovat nové prediktivní markery rozsahu onemocnění a povedou k lepšímu pochopení progrese CRC. Metody: Relativní expresi 440 genů s funkcí v nádorové biologii jsme stanovili pomocí nízkohustotních oligonukleotidových čipů u 20 klinických vzorků CRC. Výsledky: Statistickou analýzou profilů genové exprese jsme identifikovali 3 geny (HSP110, HYOU1, TCTP) se signifikantně zvýšenou expresí v primárních tumorech pacientů s metastatickým postižením lymfatických uzlin. Z toho zvýšenou expresi HSP110 a HYOU1 jsme v souvislosti s postižením lymfatických uzlin pozorovali poprvé. Změny v expresi HSP110 jsme potvrdili rovněž metodou kvantitativní PCR na nezávislé skupině 30 pacientů. Identifikovali jsme signifikantně zvýšenou hladinu HSP110 v tumorech oproti příslušné nenádorové střevní tkáni (p<0,0003). Jako první jsme popsali změny v genové expresi HSP110 mezi pacienty s metastatickým a lokalizovaným onemocněním (p=0,031) a negativně ji korelovali s celkovým přežitím pacientů s CRC. Závěr: Na základě naších pozorování předpokládáme, že HSP110 je slibným molekulárním prediktorem u pacientů s CRC. Studie B Východiska: Vývoj s metastazování koloretálního karcinomu (CRC) jsou charakterizovány mnohočetnými genetickými změnami. MikroRNA (miRNAs) jsou endogenní nekódující regulační RNA. V minulosti, především v pre-klinických studiích, byly prokázány významné změny na úrovni exprese mnoha miRNA u CRC. Metody: V naší studii jsme stanovovali hladinu exprese miR-21, miR-31, miR-143 a miR-145 ve 29 vzorcích kolorektálního karcinomu a 6 nenádorových střevních tkáních metodou kvantitativní PCR. Výsledky: Hladiny exprese všech analyzovaných miRNA se signifikantně lišily mezi nádorovou a nenádorovou tkání: miR-21 (p=0,0001) a miR-31 (p=0,0006) byly zvýšené a miR-143 (p=0,011) a miR-145 (p=0,003) byly v nádorech snížené. Jako první jsme asociovali zvýšené hladiny miR-21 s postižením regionálních lymfatických uzlin (p=0,025), rozvojem vzdálených metastáz (p=0,009) a celkovým přežitím (p=0,051) pacientů s CRC. Hladiny miR-21 jsme tedy pozitivně korelovali s klinickým stádiem (p=0,032). Nádory s maximálním průměrem vyšším než 50 mm byly navíc charakterizovány nižší expresí miR-143 (p=0,006) a miR-145 (p=0,003). Neidentifikovali jsme žádný vztah mezi analyzovanými miRNA a sérovými hladinami CEA. Závěr: Naše výsledky naznačují možné funkce miR-21, miR-31, miR-143 a miR-145 v patogenezi CRC jejich možné využití v diagnostické a prediktivní onkologii. Naše data jednoznačně potvrzují, že moderní a progresivní technologie DNA čipů a studium nově objevené regulační sítě tvořené mikroRNA, poskytují velice slibné a užitečné přístupy ve snahách o zpřesnění diagnostiky, stanovení prognózy a predikce léčebné odpovědi u pacientů s kolorektálním karcinomem.

Abstract:

Study A Objectives: Colorectal cancer (CRC) is one of the most frequent malignant disease in the world. Metastatic spread of the cancer to the lymph nodes is crutial factor for progression and therapeutic management of the disease. We suppose that analysis of gene expression profiles of CRC patiens by low-density cancer-focused oligonucleotide microarrays enable us to identify new predictive markers of the extend of disease and can lead to a better understanding of CRC progression. Methods: Relative expression levels of 440 genes known to be involved in cancer biology were obtained by low-density oligonucleotide microarrays from 20 tumor samples. Results: Statistical analysis of gene expression data identified 3 genes (HSP110, HYOU1, TCTP) significantly up-regulated in primary tumors of patients who developed lymph nodes metastasis. We have shown, for the first time, that up-regulation HSP110 and HYOU1 expression is associated with lymph nodes involvement in CRC. We validated the differences in HSP110 expression in an independent group of 30 patients of all clinical stages by Real-Time PCR method. We identified significant up-regulation of HSP110 expression in colorectal tumors compared to adjacent non-tumoral tissue (p<0,0003). For the first time, we observed significant differences of HSP110 gene expression between metastatic and localized disease (p=0,031) and negative correlation of HSP110 gene expression and overall survival of CRC patients. Conclusion: We suggest that HSP110 gene is promising molecular predictor in CRC. Study B Objectives: Development and metastases of colorectal cancer (CRC) are characterized by multiple genetic alterations. MicroRNAs (miRNAs) are endogenously expressed regulatory non-coding RNAs. Previous, mainly pre-clinical studies, showed altered expression levels of several miRNAs in CRC. Methods: In our study, the expression levels of miR-21, miR-31, miR-143, miR-145 in 29 primary colorectal carcinomas and 6 non-tumor adjacent tissue specimens were examined by Real-Time PCR. MiRNAs expression levels were also correlated with commonly used clinicopathologic features of CRC. Results: Expression levels of analyzed miRNAs significantly differed among tumors and adjacent non-tumor tissues: miR-21 (p=0,0001) and miR-31 (p=0,0006) were up-regulated and miR-143 (p=0,011) and miR-145 (p=0,003) were down-regulated in tumors. For the first time, high expression of miR-21 was associated with lymph node positivity (p=0,025) and development of distant metastases (p=0,009) and overall survival (p=0,051) in CRC patients. Thus, expression of miR-21 correlated with CRC clinical stage (p=0,032). Furthermore, tumors with more than 50 mm in maximal tumor diameter were characterized by lower expression of miR-143 (p=0,006) and miR-145 (p=0,003). We have found no correlation between analyzed miRNAs and serum levels of CEA. Conclusion: Our results suggest possible roles of miR-21, miR-31, miR-143 and miR-145 in colorectal cancer. Taken together, our data suggest that DNA microarrays as a modern and progressive technology and microRNAs as a new robust regulatory network with post-transcription regulatory efficiency are very promising and beneficial approaches for efforts focused on the improvement of the diagnosis and prognosis prediction in colorectal cancer patients.

Keywords

colorectal cancer, DNA microarrays, microRNA, prognosis, prediction

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 10. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 21. 10. 2008
• Supervisor: prof. MUDr. Rostislav Vyzula, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
General Medicine / Oncology