Identifikace a kvantifikace mikroRNA v tělních tekutinách

Bc. Viktoriia Doshchenko

Bachelor's thesis

microRNA identification and quantification in biofluids

Abstract:

V posledních desetiletích bylo prokázáno, že mikroRNA (miRNA/miR) hrají důležitou roli v regulaci mnohých fyziologických i patofyziologických procesů. Tyto molekuly patří do rodiny krátkých nekódujících RNA, které posttranskripčně regulují genovou expresi. Přestože většina miRNA je lokalizována v buňkách, část z nich proniká do tělních tekutin. Jelikož se exprese miRNA dynamicky mění v závislosti na vnějším i vnitřním prostředí buněk, představují cirkulující miRNA zajímavý cíl pro výzkum biomarkerů. Avšak jejich detekce v tělních tekutinách je komplikovaná z důvodu nízké koncentrace a nejednotné metodiky. S rozvojem nových senzitivnějších detekčních technologií vyvstává potřeba optimalizovat a sjednotit dostupné analytické metody. Tato práce se zabývá porovnáním a optimalizací tří rozdílných kvantifikačních metod (miQPCR, digitální PCR - ddPCR a sekvenování nové generace - NGS), které byly následně využity pro analýzu cirkulujících miRNA v plazmě pacientů s epilepsií. Pomocí jednotlivých technik byla stanovena exprese vybraných miRNA v plazmě pacientů těsně po epileptickém záchvatu a v období klidu. Přestože všechny testované metody umožnily detekci cirkulujících miRNA, nejlepších výsledků bylo dosaženo pomocí NGS analýzy, která odhalila v analyzovaných vzorcích 328 různých miRNA, z nichž 14 bylo odlišně exprimováno mezi dvěma studovanými skupinami. Tyto pilotní výsledky bude potřeba ověřit na rozsáhlejším souboru pacientů s využitím dalších nezávislých metod.

Abstract:

Over the past decades the microRNAs (miRNA/miR) have emerged as important regulators of various physiological and pathophysiological processes. These molecules belong to the family of short non-coding RNAs, which posttranscriptionally regulate gene expression. Although miRNAs are mostly present in cells, a portion of them enters the biofluids as well. Since the expression of miRNAs’ dynamically changes in response to both inner and outer environment of the cells, the circulating miRNAs present an interesting target for biomarker research. However, their detection in biofluids is complicated due to the low concentration and heterogenous methodology. With the recent development of more sensitive detection techniques, there is a need for optimization and unification of the available analytical methods. The present thesis deals with a comparison and an optimization of three different quantification methods (miQPCR, digital PCR - ddPCR and next generation sequencing - NGS), which were subsequently applied for the analysis of circulating miRNAs in plasma of epilepsy patients. The expression of the selected miRNAs was determined using individual techniques in plasma of patients right after the epilepsy seizure and during the interperiod. Although all tested methods enabled a circulating miRNAs detection, the best results were achieved by NGS analysis, which identified 328 different miRNAs, out of which 14 molecules were differentially expressed between the two studied groups. However, these experimental results should be necessarily verified on a larger cohort of patients utilizing other independent methods.

Keywords

mikroRNA, microRNA, biomarker, kvantitativní PCR, real-time quantitative PCR, dropletová digitální PCR, droplet digital PCR, sekvenování nové generace, next-generation sequencing

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 25. 6. 2019
• Supervisor: prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry