Detekce sacharidových struktur v glykoproteinovém profilu spermií

Bc. Tereza Němečková

Master's thesis

Detection of saccharide structure in sperm glycoprotein profile

Abstract:

Během vývoje spermie dochází k molekulárním změnám nejen uvnitř, ale i na jejím povrchu. V plazmatické membráně se reorganizují a přestavují lipidy, proteiny a sacharidy. Tyto změny vedou k dozrávání spermií. Na proteiny nebo lipidy plazmatické membrány navazuje glykoproteinový obal spermie, který také prochází posttestikulárními změnami. Glykoproteiny se v reprodukci uplatňují v různých procesech. U samčích gamet se podílejí např. na spermatogenezi, maturaci spermií, ochraně spermie při průchodu samičím pohlavním traktem, kapacitaci nebo na rozpoznávání a vazbě spermií na ZP. Glykoproteiny mohou být během maturace spermie modifikovány či relokalizovány. Tyto změny lze detekovat pomocí lektinů – bílkovin, které mají schopnost se specificky vázat na cukerné zbytky. Cílem této diplomové práce bylo detekovat vybrané sacharidové typy vazeb v glykoproteinech izolovaných ze spermií kanců a jejich porovnání v rámci individuality jedinců. Pro tyto experimenty byly využity celkem tři lektiny s různou vazebnou specifitou, byly to MAA, WGA a sWGA. K vizualizaci vazby lektinu WGA a sWGA na spermie byla využita nepřímá fluorescenční mikroskopie. Na fixovaných spermiích aceton-metanolem byly nalezeny 3 vzory vazby lektinů: po celé hlavičce, po jejím obryse nebo jen v akrozomální oblasti. Nejčastěji se objevovaly spermie se signálem po obryse hlavičky. U spermií v suspenzi byl k těmto vzorům navíc objeven další, a to signál po celé hlavičce mimo akrozomální oblast. Tento typ byl však nalezen pouze u jednoho kance. V tomto experimentu byla zjištěna nejčastější lokalizace sacharidových struktur rozpoznávaných WGA a sWGA lektiny po celé hlavičce spermie. K detekci vazby lektinů na glykoproteiny v lyzátech ejakulovaných spermií byla využita metoda Western blot, během které byly použity tři lektiny – MAA, WGA a sWGA. Po provedené denzitometrické analýze byl nalezen jediný signifikantní rozdíl v síle signálu vazby lektinu WGA mezi dvěma kanci. Navíc byly cíleně izolovány proteiny z povrchu spermií a v nich detekovány glykoproteiny rozpoznávané WGA a sWGA lektiny. Bylo nalezeno 9 skupin glykoproteinů, které byly při použití obou lektinu velmi podobných molekulových vah. Lektin WGA se navíc navázal na 2 skupiny glykoproteinů o velikosti 209 a 42 kDa. Z výsledků vyplývá, že kančí spermie během svého vývoje a maturace získává struktury, které obsahují sialovou kyselinu v multivalentní nebo α 2-6 vazbě a N-acetylglukosamin. Zároveň je ale přítomnost a rozložení některých z těchto glykanových struktur na spermii do určité míry individuální a mohou představovat nové molekulární markery pro hodnocení případně selekci spermií.

Abstract:

During the sperm development, molecular changes take place not only inside, but also on their surface. Lipids, proteins and carbohydrates are reorganized and rebuilt within the plasma membrane. These changes lead to the maturation of sperm. Proteins or lipids of the plasma membrane are followed by the glycoprotein coat of the sperm, which also undergoes posttesticular changes. Glycoproteins are involved in reproduction in various processes. In male gametes, they participate in e.g. spermatogenesis, sperm maturation, protection of sperm during passage through the female genital tract, capacitation, sperm-ZP recognition and binding. Glycoproteins can be modified or relocalized during sperm maturation. These changes can be detected using lectins - proteins that have a specific ability to bind to sugar residues. The aim of this diploma thesis was to determine selected types of carbohydrate bonds in glycoproteins isolated from boar sperm and their comparison within the individuality of boars. A total of three lectins with different binding specificities were used for these experiments, they were MAA, WGA and sWGA. Indirect fluorescence microscopy was used to visualize WGA and sWGA lectin binding to sperm. On acetone-methanol fixed spermatozoa, 3 patterns of lectin binding were found: on the entire head, along its outline or only in the acrosomal region. Sperm with a signal following the outline of the head appeared most often. For spermatozoa in suspension, another one was discovered in addition to these patterns, namely a signal on the entire head apart from the acrosomal region. This type was found in only one boar. In this experiment, the most frequent localization of carbohydrate structures recognized by WGA and sWGA lectins was detected throughout the sperm head. To detect the binding of lectins to glycoproteins in ejaculated sperm lysates, the Western blot method was used, during which three lectins - MAA, WGA and sWGA - were employed. After densitometric analysis, the only significant difference was found in the WGA lectin binding signal between the two boars. In addition, proteins were isolated from the sperm surface and glycoproteins recognized by WGA and sWGA lectins were detected. Nine groups of glycoproteins were found, which were of very similar molecular weights using both lectins. Moreover, WGA lectin bound to two groups of glycoproteins of size 209 and 42 kDa. The results show that boar spermatozoa during their development and mature gain structures that contain sialic acid in a multivalent or α 2-6 bond and N-acetylglucosamine. Together with these findings, the presence and distribution of some of these glycan structures appear to be individual and may represent new molecular markers for the evaluation or selection of spermatozoa

Keywords

glykoprotein, spermie, lektin, Western blot, kanec

Keywords

glycoprotein, sperm, lectin, Western blot, boar

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 15. 5. 2023
• Supervisor: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.
• Reader: Veronika Páleníková, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology