Povrchové modifikace paramagnetických částic pro izolaci nukleových kyselin

Bc. Petra Vopařilová

Diplomová práce

Surface modification of paramagnetic particles for nucleic acid isolation

Anotace:

Cílem diplomové práce Povrchová modifikace paramagnetických částic pro izolaci nukleových kyselin bylo optimalizovat protokol pro izolaci nukleových kyselin (NA) pomocí různě modifikovaných částic (MPs) tak, abychom maximalizovali výtěžek a kvalitu izolované NA a zároveň snížili finanční a časovou náročnost této metody. Jedním z nejdůležitějších požadavků při výběru vhodné metody izolace je, aby výsledná NA byla použitelná pro navazující aplikace. V rámci mé diplomové práce byla rovněž optimalizována real-time PCR reakce, ve které byla testována RNA získaná z izolací. V teoretické části diplomové práce je popsána struktura MPs, jejich syntéza, možnosti funkcionalizace MPs a jejich biotechnologické využití. Dále jsou popsány základní metody pro izolaci NA, podrobněji je rozepsána izolace NA pomocí MPs a možnost automatizace dané metody. V praktické části jsou uvedeny jednotlivé kroky optimalizace izolace. V rámci praktické části byly testovány MPs bez povrchové modifikace, MPs jejichž povrch byl modifikován tetraethoxysilanem (TEOS), MPs s povrchem modifikovaným tetraethoxysilanem a dále funkcionalizováným (3-amino-propyl) -triethoxysilanem (TEOS+APTES) a MPs na jejichž povrch byla navíc vnesena -COOH skupina (TEOS+APTES+COOH). Nejvhodnějšími částicemi pro izolaci RNA se zdají být MPs s modifikací (TEOS+ATES), pomocí nichž se nám podařilo v primární eluci uvolnit téměř veškerou RNA, naopak v sekundární eluci bylo uvolněno velké množství gDNA. Protokol izolace by tedy mohl být univerzální jak pro izolaci gDNA, tak pro izolaci RNA, kdy v první eluci by byla uvolněna RNA použitím elučního roztoku kyselé povahy (např. pH 6 – 6,6), v sekundární eluci by byla uvolněna gDNA použitím alkalického roztoku (např. pH 7,5 – 8). MPs (TEOS) interagují na svém povrchu s molekulou NA pravděpodobně pouze přes solný můstek, který vytvářejí chaotropní soli mezi záporně nabitými fosfátovými skupinami a záporně nabitým povrchem částic. MPs (TEOS+APTES) mají lepší vazebné schopnosti, interakce NA s povrchem MPs není zprostředkována pouze přes solný můstek, ale pravděpodobně také pomocí elektrostatických interakcí kladně nabitých aminoskupin (-NH3+) molekuly APTES s negativně nabitou molekulou NA. Výsledná RNA izolovaná pomocí MPs (TEOS+APTES) byla srovnávána s RNA izolovanou pomocí gravitační kolonky. Kvalita a integrita izolované RNA pomocí MPs byla zcela dostačující pro real-time PCR reakci, ve které byla testována.

Abstract:

The aim of the diploma thesis Surface modification of paramagnetic particles for nucleic acid isolation was to optimize the protocol for nucleic acid (NA) isolation using variously modified particles (MPs) so as to maximize the yield and quality of isolated NA and reduce the cost and time of this method. One of the most important requirements in selecting a suitable method of isolation is that the resulting NA can be used for subsequent applications. In my diploma thesis, the real-time PCR reaction was also optimized, in which RNA from isolations was tested. The theoretical part of the thesis describes the structure of MPs, their synthesis and their biotechnological use. Next, the basic methods for NA isolation are described. The isolation of NA using MPs and the possibility of automation of the method are described in more detail. In practical part the individual steps of isolation optimization are described. The results of these optimizations are also presented. In the practical part were tested MPs without surface modification, MPs whose surface was modified with tetraethoxysilane (TEOS), MPs whose surface was modified with tetraethoxysilane and then functionalized with (3-aminopropyl) -triethoxysilane (TEOS + APTES) and MPs on which surface have also been applied -COOH group (TEOS APTES COOH). The most suitable particles for RNA isolation appear to be modified MPs (TEOS + ATES), which enabled us to release almost all RNA in the primary elution, while a large amount of gDNA was released in the secondary elution. Thus, the isolation protocol could be universal for both gDNA isolation and RNA isolation, where in the first elution RNA would be released using an acidic elution solution (eg pH 6–6.6), in the secondary elution gDNA would be released using an alkaline solution (eg pH 7.5–8). MPs (TEOS) interact on their surface with the NA molecule probably only through a salt bridge, which forms chaotropic salts between the negatively charged phosphate groups and the negatively charged surface of the particles. MPs (TEOS + APTES) have better binding abilities, the interaction of NA with the surface of MPs is mediated not only through the salt bridge, but probably also by electrostatic interactions of positively charged amino groups (-NH3 +) of the APTES molecule with the negatively charged NA molecule.The resulting RNA isolated using MPs (TEOS + APTES) was compared to RNA isolated using a gravity column. The quality and integrity of the isolated RNA by MPs was sufficient for the real-time PCR reaction in which RNA was tested.

Klíčová slova

optimalizace, MPs, izolace, purifikace, RNA, DNA, real-time PCR

Keywords

isolation, RNA, DNA, real-time PCR, optimalization, MPs, purification

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 4. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Zbyněk Heger, Ph.D.
• Oponent: Barbora Tesařová, Ph.D.

Mendelova univerzita v Brně

Agronomická fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Zootechnika / Živočišné biotechnologie