Sledování funkčních parametrů spermií po inovaci kryokonzervačních médií

Bc. Gabriela Guthová

Master's thesis

Monitoring of sperm functional parameters after innovation of cryopreservation media

Abstract:

Cílem práce bylo hodnocení kančích spermií v kryokonzervačních médiích po náhradě glycerolu. Teoretická část práce byla věnována hodnocení fyziologických i patofyziologických procesů, jimiž se reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species – ROS) podílejí na metabolismu spermatických buněk. Zhoršená fertilizační schopnost spermií může často souviset právě s nadměrnou produkcí ROS. Proto je část práce věnována také způsobům vyšetření zátěže buněk volnými radikály. V rámci praktické části diplomové práce byla na spermiích kanců, býků a lidí kompletně nastavena metodika hodnocení ROS pomocí fluorochromu CellROX Deep Red. Tato analýza následně byla prováděna fluorescenční mikroskopií a průtokovou cytometrií. Nově nastavená metodika značení buněk pomocí sondy CellROX byla aplikována pro hodnocení ROS u spermií kanců, inkubovaných v kryokonzervačních médiích, ve kterých byla snížena procentuální koncentrace standardně využívaného kryoprotektantu glycerolu, za využití polysacharidu dextranu. Paralelně s ROS byla hodnocena také viabilita rozmrazených buněk, a to rovněž pomocí fluorochromu novější generace Zombie Ultra Violet dye. V rámci této práce byla potvrzena vyšší přesnost analýzy zátěže ROS pomocí markeru CellROX Deep Red oproti častěji využívané sondě H2DCFDA. Dále byl optimalizován protokol pro přípravu vzorků k hodnocení ROS pomocí fluorescenčního mikroskopu a průtokové cytometrie. Tato metoda by v budoucnosti, díky své přesnosti a možnosti vzorky fixovat, mohla dosáhnout větší a tedy praktické využitelnosti při hodnocení zátěže ROS u různých živočišných druhů. V rámci této práce však nebyl prokázán signifikantní vliv využití glycerolu v kombinaci s 20 kDa dextranem v médiu pro kryokonzervaci ejakulátu kanců (p<0,05).

Abstract:

Main goal of this theses was to analyse boar semen after substitution of glycerol in a freezing media. Theoretical part of this theses was dedicated to evaluation of physiological and patophysiological processes of ROS (reactive oxygen species) in sperm cells metabolism. Increase of ROS production may have some connection with impaired male fertility. Determination methods of oxidative stress in cells were also discussed in this part of the theses. ROS evaluation methodology by fluorochrome CellROX Deep Red on boar, bull and human semen was set in practical part of this theses. Analysis of samples was conducted by fluorescent microscopy or flow cytometry. The new methodology of cell marking by CellROX was then applied for evaluation of stress in boar sperm incubated in a freezing media with lowered procentual concentration of standardly used cryoprotectant glycerol by using dextran polysacharide. The precision of CellROX Deep Red probe was confirmed in comparison with more often used fluorochrome H2DCFDA in this thesis. Protocol optimalization of sample preparation for ROS assessment by fluorescent microsopy and flow cytometry was also accomplished. This method of ROS assessment could be used more widely and practically for evaluation of oxidative stress in various species, due to its precision and possibility to fixate the sample. Experiment performed in this theses didn't confirm significant effect of glycerol combined with 20 kDa dextran in medium for cryopreservation of boar semen (p<0,05).

Keywords

ROS, viabilita, průtoková cytometrie, fluorescenční markery, kryokonzervace

Keywords

ROS, viability, flow cytometry, fluorescent probes, cryopreservation

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology