Kvalita spermatu ovlivňuje oplození u sladkovodních ryb

MSc. Yu CHENG

Doctoral thesis

Sperm quality affects the fertilization in freshwater fishes

Abstract:

Krátkodobé uchování spermatu v líhňařské praxi ryb je hojně využívanou technikou při umělém oplození, a to díky své výhodnosti, nízké ceně a praktičnosti. V kapitole 2 byly porovnány tři techniky inkubace jiker s cílem ověřit jednoduchou a účinnou metodu inkubace oplozených jiker u jesetera malého. Bylo sledováno procento oplození, neurulace, líhnutí embryí a larev tak, aby bylo možné porovnat účinky inkubačních systémů umístění Petriho misek 1) v nádrži líhně, 2) na stole v malém inkubačním boxu v klimatizované místnosti nebo 3) v termostatickém inkubačním boxu. Mezi těmito systémy inkubace jiker v Petriho miskách nebyly zjištěny rozdíly. Získané zkušenosti umožnily využít tento způsob inkubace v Petriho miskách u dalších druhů ryb, jako jsou kapr a zebřička. V kapitole 3 byla pozornost věnována procesům aktivace a oplození jiker. U jesetera malého, jakožto modelového druhu jeseterovitých ryb bylo zásadní standardizovat postupy oplození. Byla zkoumána úroveň neurulace a míra líhnutí (%) embryí. Bylo použito více násobné ošetření spermií při oplození s různým gradientem počtu spermií a objemem aktivačního roztoku pro oplození jiker a dále stanoven minimální počet spermií při optimálním objemu aktivační vody. Pokusy s umělým oplozením ukázaly, že k úspěšnému oplození postačuje celkem 50 000 spermií v 8 ml, resp. 32 ml aktivační vody. Bylo zjištěno, že velmi nízká koncentrace 100 - 1 300 spermií v ml aktivační vody může zabezpečit účinné oplodnění při použití kvalitního spermatu. Kapitola 4 zkoumala management spermií, včetně zablokování spontánního pohybu spermií, složení umělé semenné plazmy a použití přirozené semenné plazmy z dobrého spermatu. U zebřičky se zkoumala optimalizace oplození pomocí různých metod, poměr spermie : vajíčko a minimální koncentrace spermií na ml aktivačního roztoku. Výsledky ukázaly, že extendor E400 je účinný při uchování spermií zebřiček; zkumavka s přesně definovaným množstvím 6 000 000 spermií zebřičky v extendoru E400 na 100 vajíček a 100 ?l aktivačního roztoku se ukázala být úspěšnější než použití Petriho misky. Spermie sumce velkého lze uchovat v imobilizačním roztoku po dobu až 1 týdne, přičemž si spermie zachovávají dostatečnou kvalitu pro úspěšné oplodnění a získání normálního plůdku. Bylo zjištěno, že spermie jesetera malého špatné kvality lze revitalizovat inkubací v semenné plazmě spermatu s dobrou motilitou spermií. Dosažené výsledky pomáhají stanovit metodu uchování spermií in vitro a postupy oplození u sladkovodních ryb. Kapitola 5, aktivační roztok je jedním z klíčových faktorů zabezpečující výkonnost spermiím během oplodnění. Byly použity různé aktivační roztoky, aby se otestovala praktická účinnost použití v líhni se spermiemi, které byly stárnoucí, ale zředěné v umělé semenné plazmě. Z rozsáhlých pokusů s umělým oplodněním vyplynulo, že oplození a lepivosti byly vysoké (78-87 %) po týdenním uchování spermií v umělé semenné plazmě kapra v aktivačních roztocích jako voda z líhně a roztok Perchec. Výsledky nabídly praktický základ pro další využití stárnoucího spermatu v líhni. V kapitole 6 této studie jsme použili stárnoucí sperma kapra obecného k vyhodnocení pohyblivosti a kinematiky spermií. Bylo provedeno přesné hodnocení životaschopnosti spermií, osmolality a pH semenné plazmy, aby bylo možné vyhodnotit vliv krátkodobého uchování in vitro na spermie. Byla také provedena analýza metylace DNA založená na celo genomovém bisulfitovém sekvenování k odhalení molekulárních změn stárnoucích spermií. Výsledky ukázaly, že stárnutí u spermií kapra obecného má značně negativní dopad na jejich výkonnost a na úsp

Abstract:

Short-term storage of sperm is a widely used technique during artificial fertilization in hatchery practice due to its convenient, inexpensive and practical value. Chapter 2, three egg incubation techniques were compared to supply one simple and efficiency method to incubate fertilized sterlet eggs. The percentage of cleavage, neurulation and hatching rates of embryos and larvae were examined to compare the effects of incubation systems consisting of placing Petri dishes 1) in the hatchery tank, 2) on a table in small incubation box in an air-conditioned room or 3) in a large thermostatic incubator box. No significant differences were found among these egg incubation systems. The experience gained allowed us to practice this simple method of egg incubation in Petri dishes on other fish species such as carp or zebrafish. Chapter 3, attention was paid to processes of egg activation and fertilization, which are highly important issues in fish reproductive biology. In the sterlet, multiple treatment groups with different gradient of spermatozoa number and volume of activation solution were used to fertilize eggs and further determine the minimum number of spermatozoa with optimal volume of activation water. The artificial fertilization experiments revealed that a total of 50,000 spermatozoa in 8 ml or 32 ml of activation water was sufficient for successful fertilization. It was obtained that a very low concentration of 100-1,300 spermatozoa per ml in activation water can achieve efficient fertilization with good quality sperm. Chapter 4, sperm managements including prevent sperm spontaneous movement, artificial seminal plasma composition, use of natural seminal plasma from good sperm were explored. The fertilization optimizations with different methods, spermatozoa: egg ratio and minimum sperm concentration were also examined in zebrafish. Results indicated that extender E400 was efficient during zebrafish sperm storage; a test tube with a well-defined amount of 6,000,000 zebrafish spermatozoa in E400 extender per 100 eggs and 100 ?L of activation solution has proven to be more successful than using a Petri dish. Sperm of European catfish can be collected and stored in immobilization solution for as long as 1 week for successful fertilization. Sterlet sperm with bad quality can be revitalized by incubation with seminal plasma from good sperm. The results help to establishing a sperm in vitro storage method and fertilization procedures in freshwater fishes. Chapter 5, activation solution is one of the key factors providing sperm and egg performance during fertilization. Different activation solutions were employed to test the practical application efficiency in a hatchery jar with sperm that was aged but diluted in artificial seminal plasma. The large-scale artificial fertilization trials indicated that fertilization and hatching rate were high (78-87%) after one week of sperm storage in a carp artificial seminal plasma in activation solutions as hatchery water and Perchec solution. Results offered the practical basic for the further application of aging sperm in a hatchery. Chapter 6, in this study, aged sperm in common carp was used to evaluate the sperm motility and kinematics, sperm viability, osmolality and pH of seminal plasma sperm short-term in vitro storage. DNA methylation analysis based on the whole-genome bisulfite sequencing was also performed to reveal the molecular changes of aging sperm. The results showed that aging spermatozoa in common carp has a considerable negative impact on their performance and as well as artificial fertilization success. the level of methylation at the CpG sites increased significantly with 24 hours post stripping spermatozoa compared to the fresh group, but then reduced significantly at 96 hours post stripping. The results contribute to investigate the sperm phenotype and functional changes in common carp and providing clues for understanding the molecular changes during sperm storage

Abstract:

ěšnost umělého oplodnění. Kromě toho se úroveň metylace v cytosin-fosfát-guaninových místech výrazně zvýšila u spermií 24 hodin po odběru spermatu ve srovnání se skupinou čerstvých spermií, ale poté se výrazně snížila v 96 hodinách po odběru spermatu. Výsledky přispěly k výzkumu fenotypu a funkčních změn spermií kapra obecného a k pochopení molekulárních změn při uchování spermií.

Keywords

kvalita spermatu, krátkodobé uchování spermatu, inkubace jiker, oplození, metylace DNA

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 8. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Otomar Linhart, DrSc.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery