Molekulární mechanismy a specializované role paralogů Dishevelled

Jitender Kumar, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular mechanisms and specialized roles of Dishevelled paralogs

Abstract:

Wnt signalizace je klíčová a evolučně konzervovaná dráha, která se podílí na širokém spektru biologických procesů, jako je vývoj buněk, jejich diferenciace a udržování tkáňové homeostázy. Protein Dishevelled (DVL) je hlavním cytosolickým transduktorem Wnt signálů. Genomy obratlovců obvykle obsahují tři paralogy DVL – DVL1, DVL2 a DVL3 – které sdílejí základní funkčnost v rámci Wnt signalizace. Nicméně fenotypy ztráty funkce jednotlivých DVL paralogů u myší naznačují určitý stupeň funkční divergence. Odlišné funkce mezi paralogy DVL jsou pravděpodobně řízeny rozdíly v úrovních exprese, epistatickými interakcemi nebo biochemickými vlastnostmi. Porozumění unikátním vlastnostem každého paralogu DVL je nesmírně náročné, ale nezbytné pro plné pochopení komplexní role DVL ve Wnt signalizaci. V první kapitole poskytuji komplexní přehled literatury o Wnt signalizaci a zdůrazňuji její význam jakožto klíčové inovace při vzniku živočichů. Začínám diskusí o modelu transdukce Wnt signálu, který tvoří základ našich znalostí o buněčné komunikaci a vývoji. Poté zkoumám vznikající myšlenku, že Wnt signalizace, stejně jako další klíčové buněčné procesy, probíhá ve velkých bezmembránových buněčných kompartmentech, což je zásadní pro prostorovou a časovou organizaci komponent Wnt signalizace. Ústředním bodemtéto dráhy je Dishevelled (DVL), klíčový uzel, který koordinuje přenos Wnt signálu. Následně přináším stručný přehled buněčných funkcí paralogů DVL a jejich role ve vývoji embryí obratlovců a u vrozených chorob. Na závěr se zabývám proteinovou architekturou Dishevelled s důrazem na význam konformační dynamiky a synergie mezi uspořádanými a neuspořádanými oblastmi pro jeho klíčovou funkci ve Wnt signalizaci. Ve druhé kapitole zkoumám vnitromolekulární interakci mezi PDZ doménou DVL3 a posledními osmi aminokyselinami jeho C-konce. PDZ doména DVL je promiskuitní při vazbě cílů, protože interaguje s mnoha proteiny rozpoznáváním karboxylátových skupin v jejich sekvencích. Zajímavé je, že C-konec DVL obsahuje dvě karboxylátové skupiny v těsné blízkosti. Krystalografická struktura naznačila dva vazebné režimy, které poskytují atomové detaily pro rozpoznávání jedné nebo druhé karboxylátové skupiny stejnou PDZ kapsou. Mutace prokázaly, že každá z karboxylátových skupin je dostatečná k zprostředkování vazby na PDZ. Zajímavé je, že relaxační disperzní experimenty zkoumaly dynamiku této interakce a ukázaly nový mechanismus rozpoznávání, při kterém ligand přeskakuje mezi dvěma vazebnými režimy během interakce s PDZ doménou. Tyto poznatky rozšiřují vazebný repertoár PDZ domén a mohou sloužit jako další vrstva funkční regulace pro rodinu proteinů DVL. Ve třetí kapitole představím rámec pro identifikaci specifických rysů jednotlivých paralogů na základě sekvenční analýzy. Tato analýza odhalila především charakteristický rys, který na molekulární úrovni odlišuje DVL3 od jeho paralogů. Integrace dat z různých strukturálních technik ukázala, že DVL3 získal disulfidovou vazbu, která představuje nové topologické rozšíření PDZ domény. Tato disulfidová vazba je redoxně aktivní a umožňuje DVL3 přecházet mezi redukovaným a oxidovaným stavem v reakci na změny v redoxním prostředí. Nakonec byly zkoumány redoxní interakce s Nucleoredoxinem (NRX). In vitro experimenty ukázaly, že NRX působí jako scaffold pro všechny tři DVL paralogy, ale v reakci na reaktivní formy kyslíkuoxiduje DVL3 tím, že se zapojuje do redoxního přenosu. Tyto poznatky naznačují, že DVL3 má ve své rodině specializovanou roli jako redoxní senzor, který může být regulován oxidoreduktázou NRX. Tato práce poskytuje nové mechanistické poznatky o specializaci par

Abstract:

alogů DVL a odhaluje molekulární vodítka pro odlišné role v buněčných procesech. Objev, že DVL3 reaguje na redoxní podmínky, představuje ověřitelnou hypotézu o Wnt signalizaci v reakci na reaktivní formy kyslíku a připravuje půdu pro budoucí studie.

Abstract:

Wnt signaling is a critical and evolutionarily conserved pathway involved in a wide range of biological processes, such as cell development, differentiation, and tissue homeostasis. Dishevelled (DVL) protein is the key cytosolic transducer of Wnt signals. Vertebrate genomes typically contain three DVL paralogs — DVL1, DVL2, and DVL3 — which are known to share basic functionality in Wnt signaling. However, the loss-of-function phenotypes of individual DVL paralogs in mice suggest some degree of functional divergence. The distinct functions among the DVL paralogs are likely driven by differences in expression levels, epistatic interactions, or biochemical properties. Understanding the unique properties of each DVL paralog is extremely challenging but essential for fully grasping DVL’s comprehensive role in Wnt signaling. In Chapter 1, I provide a comprehensive literature overview on Wnt signaling, emphasizing its significance as a key innovation in the origin of animals. I begin by discussing the textbook model of Wnt signal transduction, which has been foundational in our knowledge of cell communication and development. From there, I explore the emerging idea that Wnt signaling, like other key cellular processes, is carried out in large non-membrane-bound cellular compartments, crucial for the spatial and temporal organization of Wnt signaling components. Central to this pathway is Dishevelled (DVL), a critical hub that orchestrates Wnt signal transduction. I then recapitulate a concise overview of the cellular functions of DVL paralogs and their role in vertebrate embryonic development and congenital disease. In the end, I discuss the protein architecture of Dishevelled, focusing on the significance of the conformational dynamics and the order-disorder synergy for its critical function in Wnt signaling. In Chapter 2, I investigate the intramolecular interaction between the PDZ domain of DVL3 and the last eight amino acids of its C-terminus. The PDZ domain of DVL is promiscuous in target binding as it interacts with multiple proteins by recognizing carboxylate moieties in their sequences. Interestingly, the DVL C-terminus contains two carboxylates in proximity. The crystallographic structure suggested two binding registers, providing the atomic details for the recognition of one or the other carboxylate moiety by the same PDZ pocket. Mutational analysis demonstrated that either of the carboxylate moieties is sufficient to mediate PDZ binding. Interestingly, relaxation dispersion experiments probed the dynamics of the interaction and demonstrated a novel recognition mechanism in which the ligand shuffles between the two binding modes as it engages with the PDZ domain. These findings expand the binding repertoire of PDZ domains and may serve as an additional layer of functional regulation for the DVL protein family. In Chapter 3, I introduce a framework for identifying paralog-specific features based on sequence analysis. Notably, this analysis uncovered a signature feature that distinguishes DVL3 from its paralogs at the molecular level. The integration of data by different structural techniques demonstrated that DVL3 has acquired a disulfide bridge which represents a novel topological extension of the PDZ fold. The disulfide bridge is redox-active, allowing DVL3 to transition between reduced and oxidized states in response to changes in the redox environment. Last, the redox-responsive interactions with Nucleoredoxin (NRX) were examined. The in vitro experiments showed that NRX acts as a scaffold for the three DVL paralogs, but in response to reactive oxygen species, it oxidizes DVL3 by engaging in a redox relay. Taken together, these findings indicate that DVL3 has a specialized role within the DVL family as a redox sensor, that could be regulated by the NRX oxidoreductase. In summary, the present work provides new mechanistic insights into the specialization of DVL paralogs, revealing the molecular cues for distinct rol

Abstract:

es in cellular processes. The discovery that DVL3 is responsive to redox conditions provides a testable hypothesis about Wnt signaling in response to reactive oxygen species and lays the groundwork for future studies.

Keywords

Wnt signaling, Dishevelled paralogs, PDZ domain, Nucleoredoxin, redox biology, order-disorder transition, biomolecular interactions, nuclear magnetic resonance

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 9. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 22. 10. 2024
• Supervisor: Ph.D. Konstantinos Tripsianes
• Reader: Mgr. Kvido Stříšovský, Ph.D., Prof. Gunnar Schulte, Remy Sounier, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Life Sciences / Life Sciences