Mutační analýza genu RYR1 zodpovědného za maligní hypertemii

RNDr. Iveta Valášková, Ph.D.

Doctoral thesis

Mutational analysis of RYR1 gene associated with malignant hyperthermia

Abstract:

Maligní hypertermie (MH) je autozomálně dominantní, potencionálně fatální farmakogenetické onemocnění, které může vest k narušení homeostázy intracelulárního kalcia, jestliže jsou vnímaví jedinci vystaveni expozici volatilních anestetik a depolarizujích relaxancií. Rané symptomy akutní MH krize zahrnují vzestup vydechovaného EtCO2, spasmus žvýkacích svalů, hypertermii a tachykardii, pozdní symptomy mohou být koagulopatie, generalizovaná rigidita svalstva a smrt. Protože MH je subklinická myopatie, jedinci vnímaví k MH (MHS) jsou v běžném životě asymptomatičtí. V nepřítomnosti spouštěcích látek je diagnóza stanovena pomocí in vitro kontrakčního testu (IVCT). Toto vyšetření je velmi invazivní a vyžaduje otevřenou biopsii svalu. Svalová vlákna jsou pak vystavena expozici halotanu a kofeinu. Molekulárně genetické studie ukázaly MH jako lokusově i alelicky heterogenní onemocnění. Nicméně, více než 70% MH rodin ukazuje genetickou vazbu ke genu pro ryanodinový receptor skeletálního svalstva na chromozomu 19q13. Recentní data ukazují, že mutace v genu RYR1 jsou nahromaděny ve třech mutačních „hot spot“ oblastech. Podle současných publikovaných doporučení, potvrzení MH mutace umožňuje stanovit diagnózu MHS. Molekulárně genetické testování mutací v genu pro ryanodinový receptor (RYR1) by mohlo vést k rychlejším výsledkům u příbuzných potvrzených MHS jedinců. V rodinách se známou kauzální mutací je přibližně 50% pravděpodobnost potvrzení MHS pomocí neinvazivního testu, což snižuje náklady na zdravotní péči. V rámci své disertační práce, jsem zavedla systematický genetický screeningový program pro MH probandy. Postup molekulárně genetického vyšetření jsem navrhla dle doporučení Evropské skupiny maligní hypertermie (EMHG) pro molekulárně genetickou diagnostiku MHS. Do rutinního vyšetřovacího algoritmu MHS pacientů bylo zavedeno a optimalizováno mnoho technik, jako sekvenování DNA/cDNA “hot spot”oblastí genu RYR1, analýza teploty tání Real-Time PCR, MLPA nebo QF PCR. Molekulárně genetickými postupy bylo vyšetřeno 229 pacientů ze 47 rodin. Všichni probandi byli potvrzeni jako MHS pomocí IVCT z důvodu pozitivní osobní nebo rodinné anamnézy. IVCT testy byly prováděny podle protokolu EMHG v Národním centru maligní hypertermie ve Fakultní nemocnici u sv. Anny v Brně. Pomocí screeningu „hot spot“ regionů genu RYR1 v DNA izolované z nesrážlivé periferní krve a cDNA ze svalové tkáně, bylo detekováno devět různých substitucí u 24 ze 47 probandů, takže míra detekce mutací je 51%. To, že byla pouze u poloviny MHS jedinců našeho souboru identifikována mutace, ukazuje nutnost analýzy celé kódující oblasti genu RYR1. Jako techniku, která zrychlí a zpřesní screening mutací a jejich identifikaci, jsem zvolila masivně paralelní sekvenování neboli novou generaci sekvenování (next generation sequencing, NGS). Byla zvolena NGS aplikace paralelní sekvenování cílových sekvencí získaných pomocí hybridizace s komplementárními sondami (Hybridization-based capture sequencing-SeqCap) a jako cílové sekvence byly zvoleny celé kódující sekvence genu RYR1 a CACN1S. V prvním pilotním běhu bylo vyšetřeno 6 MHS jedinců. U 3 jedinců byla detekována MH kandidátní mutace. Naše první zkušenosti s NGS v diagnostice MH potvrdili můj předpoklad, že tato nová technika výrazně zlepší mutační screening u MH rodin. Předpokládám, že v budoucnu NGS nahradí konvenční sekvenování v diagnostice MH.

Abstract:

Malignant hyperthermia (MH) is an autosomal, dominantly inherited, potentially fatal pharmacogenetic disorder which may lead to a disturbance of intracellular calcium homeostasis when susceptible individuals are exposed to volatile anaesthetics and depolarizing muscle relaxants. Early symptoms of an acute MH crisis include increased carbon dioxide in expired air, possible masseter spasm, hyperthermia and tachycardia, whereas late symptoms can be coagulation disturbances, generalized muscle rigidity and death. Because MH is a subclinical myopathy, person susceptible to MH (MHS) are asymptomatic during daily life. In the absence of triggering agents, the diagnosis of MHS can be established with the in vitro contracture test (IVCT). This investigation is highly invasive and required an open muscle biopsy. Muscle strips are exposed to halothane and caffeine. Molecular genetic investigations in MH have shown considerable locus and allelic heterogeneity. However, more than 70% of MH families show genetic linkage to skeletal muscle ryanodine receptor gene on chromosome 19q13. The accumulating data reveal that mutations of RYR1 found in MHS people are mostly single mutations located in tree hotspots. According to recently published guidelines, the presence MH mutation allows for the diagnosis of MH susceptibility. Molecular genetic testing for causative mutations in the ryanodine receptor gene (RYR1) of the index case could lead to quicker results for the rest of the kinship. In families with known MH causative mutations, there is nearly a 50% chance to reliably confirm MH susceptibility by a noninvasive test, thus reducing health care cost and improving anaesthesia risk management. We have performed a systematic molecular genetic screening program for MH probands. The protocol of molecular genetic analysis of RYR1 gene was designed according to EMHG guidelines for molecular genetic diagnosis of MH susceptibility. Many techniques has been implemented and optimized such as DNA/cDNA “hot spot” sequencing, melting analysis on Real-Time PCR, MLPA or QF PCR to the routine diagnostics screening algorithm in MHS patients. In this study, 229 patients from 47 different families underwent molecular genetic testing. All probands had suffered serious clinical reactions and thereafter been tested MHS by IVCT according to protocol of the European Malignant Hyperthermia Group. IVCTs were carried out at the National MH Centre of University Hospital at St. Anna in Brno. Upon screening of most reported hotspots regions of the RYR1 gene from DNA derived from peripheral blood leukocytes and cDNA derived from muscle tissue, 9 different amino acid substitutions were identified in 24 of 47 probands raising rate 51%. Only RYR1 hotspots were screened on genomic DNA and cDNA. According to our sequencing results, in about half of the patients included in our cohort, we identified candidate mutation. This highlights the importance of examining all 106 exons of RYR1 when screening MH probands. The application of massively parallel sequencing also called next generation sequencing, as a routine strategy could lead to a rapid screening and fast identification of mutations in rare genetic disorders like MH. Hybridization-based capture sequencing targeted entire coding regions either RYR1, CACN1S genes we used to investigate 6 MHS individuals. In three individuals, candidate mutations were detected. The initial experiences with NGS MH diagnostics show that the implementation of this new technique would help to provide accurate mutation screening in MHS families. NGS assays will soon replace conventional sequencing for MH diagnostics.

Keywords

maligní hypertemie, molekulární diagnostika, ryanodinový receptor, gen RYR1

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 12. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 30. 1. 2014
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc., doc. RNDr. Radek Vrtěl, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Genetics