Studium mechanismu degradace RNA komplexem TRAMP-exosome

Bc. Jan Škerle

Diplomová práce

Mechanism of RNA degradation by the TRAMP-exosome complex

Anotace:

Zinkový protein ZCCHC7 je lidským homologem kvasinkového proteinu Air2 a patrně se stejně jako on podílí na kontrole kvality RNA. Konkrétně je protein Air2 jako jedna z podjednotek multiproteinového komplexu TRAMP zodpovědný za vazbu k RNA. Cílem této práce bylo vyřešit strukturu proteinu ZCCHC7 (jeho 5 zinkových domén) pomocí NMR a prostudovat jeho vazebné schopnosti s RNA. Zvolený konstrukt ZCCHC7 (5Zn domén) byl úspěšné klonován do expresního vektoru pSMT3, tento vektor byl transformován do buněk BL21 CodonPlus (DE3) RIPL. Protein ZCCHC7 (5Zn domén) byl exprimován v konjugaci se solubilní značkou SMT3. Postupně byly optimalizovány jak podmínky pro kultivaci, tak složení lyzačního, promývacího a elučního pufru. Solubilní značka byla odštěpena proteinasou Ulp1, v průběhu experimentu se však nepodařilo nalézt optimální podmínky pro oddělení studovaného proteinu od solubilní značky SMT3. Vzhledem k tomuto problému se studovaný protein nepodařilo získat v dostatečném množství a čistotě pro provedení měření NMR. Na základě poznatku, že Air2 váže poly(A) RNA (dosud nepublikované výsledky Mgr. Hany Černé), bylo pomocí fluorescenční anizotropie dokázáno, že ZCCHC7 také váže tento substrát.

Abstract:

Zinc protein ZCCHC7 is the human homolog of yeast protein Air2 and appears to have similar function as Air2, as it co-works on RNA quality control. As a subunit of multi-protein complex TRAMP, Air2 works as RNA binding protein. The aim of a present study is to resolve structure of ZCCHC7 protein (concretely, its 5 zinc domains) with NMR. Furthermore, we focused on binding abilities of the protein to RNA. DNA construct ZCCHC7 (5Zn domain) was succesfuly cloned into expression vector pSMT3. This vector was transformed into BL21 CodonPlus (DE3) RIPL cells. Protein ZCCHC7 (5Zn domain) was expressed in conjunction with solubility tag SMT3. Cultivation conditions were subsequently optimalized, as well as lysis, wash and elution buffer composition. Solubility tag was cleaved by Ulp1 protease, but during the experiment optimal conditions for ZCCHC7 - SMT3 separation could not be found. Considering this problem, we were not able to gain sufficient quantity and purity of the protein to run NMR measures. With regard to yet unpublished findings of Hana Cerna that Air2 binds poly(A) RNA, by fluorescence anisotropy application it was succesfully proved that ZCCHC7 binds this substrate as well.

Klíčová slova

ZCCHC7, exosom, TRAMP, RNA quality control, zinc protein

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2011
• Vedoucí: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie