Vliv hyaluronanu na aktivaci myších makrofágů

Bc. Barbora Šafránková, Ph.D.

Master's thesis

Modulation of mouse macrophage activation by hyaluronan

Anotácia:

Hyaluronan je jednou z hlavních glykosaminoglykanových složek extracelulární matrix a jako takový se účastní celé řady fyziologických i patofyziologických dějů. Jeho biologické působení závisí na velikosti molekuly. Za normálních podmínek se ve tkáních nalézá ve formě vysokomolekulárního polymeru. Ten udržuje tkáňovou integritu, inhibuje proces angiogeneze, potlačuje buněčnou diferenciaci, je protizánětlivý a imunosupresivní. Během poškození tkáně a zánětu je přirozeně se vyskytující vysokomolekulární hyaluronan štěpen za vzniku kratších fragmentů, které působí odlišně. Působí prozánětlivě, podporují angiogenezi a jsou imunostimulační, protože mohou působit jako endogenní signály nebezpečí. Hlavním cílem této práce bylo popsat působení hyaluronanu o vybraných, přesně definovaných, molekulových hmotnostech na aktivaci myších makrofágů. Hyaluronan o molekulových hmotnostech 52, 87, 250 a 970 kDa byl testován v jedné zvolené koncentraci (0,5 mg/ml) na klidových ale i lipopolysacharidem aktivovaných makrofázích. Byly použity dvě myší makrofágové linie – peritoneální RAW 264.7 a alveolární MH-S. Byla sledována životnost pomocí spektrofotometrického měření celkové koncentrace proteinů v buněčném lyzátu. Jako ukazatel zánětlivé aktivace byla sledována tvorba nitritů spektrofotometrickou Griessovou metodou a fluorescenční metodou. S využitím imunoenzymatické metody byla stanovena produkce alfa faktoru nekrotizujícího nádory. Western blot byl použit pro ověření exprese inducibilní syntézy oxidu dusnatého. Experimenty navzdory očekávání neukázaly významný stimulační ani inhibiční efekt v závislosti na použité molekulové hmotnosti hyaluronanu, s výjimkou v produkci alfa faktoru nekrotizujícího nádory. Všechny molekulové hmotnosti hyaluronanu snižovaly produkci alfa faktoru nekrotizujícího nádory indukovanou lipopolysacharidem, zvláště 970 kDa hyaluronan. Není možné potvrdit hypotézu, že po ovlivnění makrofágů nízkomolekulárním hyaluronem se zvyšuje exprese inducibilní syntázy oxidu dusnatého, stejně jako nelze říci, že vysokomolekulární hyaluronan tlumí expresi proteinu zodpovědného za tvorbu NO u makrofágů.

Abstract:

Hyaluronan is one of the basic glykosaminoglycan components of extracellular matrix and as such it shares series of physiological and pathophysiological actions. The biological action depends on its molecular size. Under normal conditions hyaluronan exists in its native form as a high molecular weight polymer in tissue. This form supports tissue integrity, inhibits process of angiogenesis, suppresses cell differentiation and it is also anti-inflammatory and immunosupressive. During tissue injury and inflammation native high molecular weight hyaluronan is cleaved and smaller fragments are formed that function in the way distinct from the native molecule. They are pro-inflammatory, angiogenic and immunostimulatory because they appear to function as endogenous danger signals. The major aim of this study was to describe an effect of selected, exactly defined molecular weights of hyaluronan on activation of murine macrophages. Hyaluronan with molecular weight of 52, 87, 250 and 970 kDa was tested in one selected concentration (0,5 mg/ml) on native but also lipopolysacharide-activated macrophages. Two murine macrophage lines – peritoneal RAW 264.7 and alveolar MH-S were used. Cell viability was observed by employing of spectrophotometrical measurement of total protein concentration in lysated cells. Like an indicator of inflammatory activation, a production of nitrites was measured by spectrophotometrical Griess assay and by fluorescent method. A production of tumor necrosis factor alpha was determined by employing of immunoenzymatic method. An expression of inducibile nitric oxide synthase was evaluated by western blot. Despite of expectation, experiments did not show significant induction or inhibition effect depending on used molecular weight of hyaluronan, except in the production of cytokine tumor necrosis factor alpha. All molecular weights of hyaluronan decreased lipopolysachareide- induced production of tumor necrosis factor alpha, especially 970 kDa hyaluronan. It is not possible to confirm the hypothesis that expression of nitric oxide synthase increases after the treatment of macrophages by low molecular hyaluronan, as well as it is not possible to say that low molecular weight hyaluronan downregulates an expresion of protein responsible for production of nitric oxide in macrophages.

Kľúčové slová

hyaluronan, myší makrofágy, faktor nekrotizující nádory, inducibilní syntáza oxidu dusnatého hyaluronan, mouse macrophages, tumor necrosis factor, inducible nitric oxide synthase

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 6. 2010
• Vedúci: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biology / General Biology