Detekční systémy pro studium (ant)agonismu látek a směsí pro retinoidní a thyroidní receptory

Bc. Tomáš Kotačka

Bachelor's thesis

Detection systems for studying (ant) agonism of compounds and mixtures for retinoid and thyroid receptors

Abstract:

Retinoidní (RAR a RXR) a thyroidní (THR) receptory patří do nadrodiny jaderných receptorů, které hrají důležitou úlohu v regulaci řady klíčových fyziologických procesů, zejména vývoje, růstu a metabolismu. Aktuální studie poukazují na možné ovlivnění jejich regulace látkami znečišťujícími životní prostředí. Tato práce se zaměřuje na přístupy a metody, které by umožnily citlivou a rychlou detekci látek schopných interagovat s těmito receptory. Takové metody jsou následně aplikovatelné jak ve výzkumu, tak průmyslu. Pro hodnocení environmentálních vzorků, které obsahují široké spektrum různých látek by mohl být vhodnou metodou pull down test, který je založen na interakci ligand vazebné domény (LBD) s ligandem. Tato práce popisuje první kroky, které jsou důležité pro vytvoření takového pull down testu. Jako expresní systém byl vybrán Escherichia coli BL21 (DE3), jenž je vhodný pro práci s novými proteiny. Jakožto expresní vektor pro lidské geny LBD receptorů RAR, RXR a THR byl vybrán pET-28a+, jehož výhodou je možnost vložení polyHis afinitního tagu na N- či C- konec proteinu, jenž usnadňuje purifikaci exprimovaného proteinu. Byly nadesignovány vektory pro všechny varianty LBD jmenovaných receptorů. Kdy u vektorů s RARα LBD, RXRα LBD a THRα LBD byla ověřena jejich funkčnost, a následně u těchto proteinů byly optimalizovány základní purifikační podmínky. Pro RARα LBD a RXRα LBD bylo stanoveno pH 7 a vhodný pufr TRIS nebo HEPES, a pro THRα LBD bylo stanoveno pH 9 a jako vhodný pufr EPPS. Dále bylo zjištěno, že iontová síla v rozmezí 50 až 600 mM nemá velký vliv na purifikaci jednotlivých proteinů. Výsledky experimentální části ukázaly základní informace o optimalizaci purifikačních podmínek a rozpustnosti studovaných proteinů, které poslouží při vývoji pull down testů založených na interakci LBD retinoidního, nebo thyroidního receptoru s ligandem.

Abstract:

Retinoid (RAR and RXR) and thyroid (THR) receptors belong to the superfamily of nuclear receptors, which play an important role in the regulation of a number of key physiological processes, especially development, growth and metabolism. Current studies point to the possible influence of their regulation by environmental pollutants. This work focuses on approaches and methods that would allow sensitive and rapid detection of substances capable of interacting with these receptors. Such methods are then applicable in both research and industry. For the evaluation of environmental samples that contain a wide range of different substances, a pull down assay based on the interaction of a ligand binding domain (LBD) with a ligand could be a suitable method. This work describes the first steps that are important for creating such a pull down assay. In this work, Escherichia coli BL21 (DE3) was selected as the expression system, which is suitable for working with new proteins. As the expression vector for the human genes of the RAR, RXR and THR LBD pET 28+ was selected, whose advantage is the possibility of inserting a polyHis affinity tag at the N- or C-terminus of the protein, which facilitates purification of the expressed protein. Vectors for all LBD variants of these receptors have been designed. For the vectors with RARα LBD, RXRα LBD and THRα LBD their functionality were tested, and subsequently the basic purification conditions for these proteins were optimized. For RARα LBD and RXRα LBD, pH 7 and as a suitable buffer TRIS or HEPES were determined, and for THRα LBD, pH 9 and as a suitable buffer EPPS were determined. Furthermore, it has been found that the ionic strength in the range of 50 to 600 mM does not have a great influence on the purification of individual proteins. The results of the experimental part showed basic information on the optimization of purification conditions and solubility of the studied proteins, which will be used in the development of pull down assays based on the interaction of retinoid or thyroid receptor's LBD with ligand.

Keywords

detekční systémy, heterologní exprese, jaderné receptory, receptor kyseliny retinové, retinoidní x receptor, thyroidní receptor, detection systems, heterologous expression, nuclear receptors, retinoic acid receptor, retinoid x receptor, thyroid receptor

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 6. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 16. 7. 2020
• Supervisor: Ing. Marie Smutná, Ph.D.
• Reader: Mgr. Zuzana Toušová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry