Biochemická analýza luciferasového komplexu

Bc. Daniel Pluskal

Bachelor's thesis

Biochemical analysis of a luciferase complex

Abstract:

Luciferasa z Renilla reniformis (RLuc) je jedním z biotechnologicky nejvíce využívaných bioluminiscenčních enzymů, zejména pak v oblasti zobrazovacích technologií. RLuc katalyzuje oxidaci svého substrátu, koelenterazinu, za emise fotonu o vlnové délce ~480 nm. Přítomnost zeleného fluorescenčního proteinu z R. reniformis (RGFP) při této reakci posouvá maximum emise na ~509 nm za současného zvýšení kvantového výtěžku bioluminiscence. Za příčinu tohoto jevu se předpokládá rezonanční přenos bioluminiscenční energie (BRET) z RLuc na RGFP prostřednictvím jejich přímé fyzické interakce. V rámci této bakalářské práce byl in vitro rekonstituován makromolekulární komplex osmibodového mutantu RLuc (RLuc8) a RGFP, v němž byl experimentálně prokázán správný průběh BRET. V práci byla dále stanovena vazebná afinita RLuc8 a RGFP a její ovlivnění přítomností analogu substrátu a produktu luciferasové reakce. Tato práce se dále zabývá stanovením vlivu molekulární interakce RLuc8 a RGFP na katalytické konstanty luciferasové reakce RLuc8 a nakonec návrhem možností racionálního inženýrství komplexu RLuc8/RGFP. Výsledky této bakalářské práce představují základní bio-chemickou charakterizaci komplexu RLuc8/RGFP nejen jako základ pro pochopení jeho biologické funkce a významu, ale také jako výchozí bod pro jeho inženýrství a konstrukce fúzních reportérových proteinů s perspektivou praktického využití kombinujícího výhody luminiscenčního a fluorescenčního značení.

Abstract:

Luciferase from Renilla reniformis (RLuc) is one of the most biotechnologically utilized bioluminescent enzymes, especially in the field of bioimaging technologies. RLuc catalyzes the oxidation of its substrate, coelenterazine, followed by emission of a photon of wavelength ~480 nm. The presence of green fluorescent protein from R. reniformis (RGFP) during this reaction shifts the emission maximum to ~509 nm while simultaneously increasing the bioluminescence quantum yield. A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) from RLuc to RGFP via their direct physical interaction is regarded as a molecular basis underlying this phenomenon. In this bachelor’s thesis, a macromolecular complex of an eight-point mutant of RLuc (RLuc8) and RGFP was reconstituted, and within which, proper BRET was experimentally proved. Furthermore, the binding affinity of RLuc8 and RGFP was determined along with whether it is influenced by the presence of an analog of substrate or products of the luciferase reaction. The thesis further focuses on the determination of the effect of the molecular interaction of RLuc8 and RGFP on the catalytic constants of the luciferase reaction of RLuc8 and finally on a proposal of possibilities of rational engineering of the RLuc8/RGFP complex. The results gained in this bachelor’s thesis represent a fundamental biochemical characterization of the RLuc8/RGFP complex not only as a basis for understanding its biological function but also as a starting point towards its engineering and construction of reporter fusion proteins with a perspective of practical applications combining the advantages of luminescent and fluorescent labeling.

Keywords

luciferasa, bioluminiscence, Renilla reniformis, koelenterazin, protein-proteinová interakce, zelený fluorescenční protein, přenos energie, BRET, vazebná afinita, enzymová kinetika, luciferase, bioluminescence, coelenterazine, protein-protein interaction, green fluorescent protein, energy transfer, binding affinity, enzyme kinetics

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 6. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 8. 7. 2021
• Supervisor: Ing. RNDr. Martin Marek, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry