Testování rezistence B-CLL buněk s mutantní a wild-type konformací proteinu p53 na chemoterapii a jejich senzitivizace monoklonální protilátkou rituximab

Bc. Ludmila Ročňová, Ph.D.

Diplomová práce

Testing of resistance of B-CLL cells with mutant nad wild-type conformation of p53 protein to chemotherapy and their sensitization with monoclonal antibody rituximab

Anotace:

Aberace dvou kooperujících genů, p53 a ATM, významně zhoršují prognózu a možnosti léčby u B-CLL pacientů. Monoklonální protilátka rituximab (anti CD20) je u B-CLL více využívána v kombinovaných terapeutických režimech, často obsahujících fludarabin. Existuje velmi málo in vitro dat, která ukazují efekt tohoto obvyklého treatmentu B-CLL buněk s aberantním p53 a/nebo ATM. Data, která by ukazovala efekt kombinace rituximabu a chlorambucilu, také chybí. Cílem práce bylo určit in vitro efekt výše zmiňovaných kombinací látek na B-CLL buňky s různým p53/ATM statutem. Pro určení delecí p53 a ATM byla použita metoda I-FISH. Jako doplněk screeningu p53 pro určení mutací p53 byla použita funkční analýza FASAY spojená se sekvenováním. Pro monitorování efektu použitých látek na buněčnou viabilitu byl použit WST-1 assay. Byl použit in vitro systém neobsahující aktivní lidskou plazmu, takže byl vyloučena lýze komplementem jako mechanismus učinku rituximabu. Po předošetření buněk rituximabem (10 ug.ml-1, 72 hod) byla přidána chemoterapeutika ve čtyřech koncentracích (F: 25 – 0,4 ug.ml-1; CLB: 50 – 6,25 uM) a buňky byly kultivovány dalších 48 hod. Pro určení významnosti účinku pretreatmentu rituximabem byla použita multivariační analýza MANOVA. Na kombinaci rituximab/fludarabin bylo testováno 46 vzorků (procento B-CLL lymfocytů bylo přes 90 %) s následujícími charakteristikami: 14 vzorků bylo wild-type, 14 mělo deleci ATM (průměr deletovaných buněk byl 83 %) a 18 vzorků obsahovalo různé defekty p53 – inaktivované obě alely (del/mut nebo mut/mut) nebo inaktivaci pouze jedné alely (del nebo mut). Senzitivita k fludarabinu byla stanovena pro koncentraci 1,6 ug.ml-1, která poskytovala významné rozdíly mezi testovanými vzorky. Vzorky byly rozčleněny následovně: rezistentní – viabilita testovaných buněk byla vyšší než 60 %; středně citlivé – viabilita buněk byla v rozmezí 60 – 40 %; citlivé – viabilita buněk byla nižší než 40 %. Vzorky s defekty v p53 byly většinou rezistentní (72 %) a žádný nebyl citlivý. Ze 14 vzorků s delecí ATM bylo 35,5 % vzorků na fludarabin citlivých, což bylo mnohem více než u wild-type vzorků (14 %). Rituximab samotný slabě zvyšoval metabolickou aktivitu u většiny vzorků (obvykle na 110 – 130 %) ve srovnání s neošetřenou kontrolou, úbytek byl zaznamenám spíše výjimečně (do 80 %). Když byla viabilita buněk treatovaných fludarabinem a buněk treatovaných rituximabem a fludarabinem vztažena na netreatovanou kontrolu, byl na hladině významnosti P = 0,05 zaznamenám pozitivní senzitivizační efekt rituximabu u 33 % vzorků s aberacemi p53, 36 % vzorků s delecí ATM a 57 % wild-type vzorků. U testování kombinace rituximab/chlorambucil, které bylo prováděno jako pilotní studie stejným způsobem u 16 vzorků, byl také zaznamenám pozitivní senzitivizační efekt pretratmentu rituximabem u některých vzorků ve všech třech skupinách. Výsledky indikují, že p53/ATM status je determinující pro senzitivitu B-CLL buněk k fludarabinu. Senzitivizace rituximabem pro fludarabin je nezávislá na aberacích p53 a ATM. Pilotní data testování kombinace rituximab/chlorambucil toto podporují.

Abstract:

Aberrations of two co-operating genes, the p53 and ATM, significantly deteriorate prognosis and treatment options for B-CLL patients. Monoclonal antibody rituximab (anti-CD20) is preferably used in combination regimens in B-CLL, often in those containing fludarabine. Very few in vitro data exist, however, showing an effect of such common treatment on B-CLL cells with aberrant p53 and/or ATM. In this respect, the data are also missing for a potential application of rituximab with chlorambucil. The aims were to assess the in vitro effect of the above mentioned combinations of drugs on B-CLL cells with various p53/ATM status. An interphase FISH was used for a determination of p53 and ATM deletions. Functional FASAY analysis coupled to sequencing was employed to supplement the screening also for p53 mutations. A metabolic WST-1 assay monitored the drugs effect on cell viability. An in vitro system lacking active human plasma was used, thus omitting the CDC pathway. After rituximab pre-treatment (10 ug.ml-1, 72 h) the chemotherapeutics were applied in four concentrations for additional 48 h (F: 25 - 0,4 ug.ml-1; CLB: 50 - 6,25 uM). Two-way analysis of variance (MANOVA) was used for determination of rituximab pre-treatment significance. For the rituximab/fludarabine combination we tested 46 samples having a median 90 % of B-CLL lymphocytes, with the following characteristics: 14 were wild-type, 14 harbored ATM deletion (median 83 % of deleted cells) and 18 exhibited p53 defects of various complexity - both alleles inactivation (del/mut and mut/mut) as well as the separate (one allele) aberrations (del or mut). The sensitivity to fludarabine was determined for the concentration 1,6 ug.ml-1, which provided significant differences among the samples. The sensitivity was assessed as follows: resistant - viability is over 60 %; medium - viability is between 60 % and 40 %; sensitive - viability is lower 40 %. The p53-affected samples were mostly resistant (72 %) and none were sensitive. Among ATM deleted samples, on the contrary, 35,5 % were sensitive, what was more than in wild-type subgroup (14 %). Rituximab alone slightly increased a metabolic activity in most of samples, usually to 110 - 130 % compared to untreated controls, while rarely a decrease was also noted (up to 80 %). When the viability of fludarabine-tretead and rituximab/fludarabine-treated samples was assessed in relation to fully untreated control, the positive sensitization effect of rituximab pre-treatment (P = 0,05) was noted as follows: within the p53-affected as well as ATM-deleted subgroups in 33 % (36 %) of samples and within the wild-type subgroup in 57 % of samples. For the rituximab/chlorambucil testing, which was performed as a pilot study in the same manner in eight samples, the positive effect of antibody pre-treatment was also noted in some samples of all the three subgroups. Our results indicate that the p53/ATM status is critical for the sensitivity of B-CLL cells to fludarabine. Regardless of the p53 and ATM aberrations, some samples are available for the rituximab-mediated sensitization to this agent. Our pilot data also support a warranty of testing a combined regimen containing rituximab and chlorambucil.

Klíčová slova

B-CLL, rituximab, fludarabin, viabilita, in vitro testování, p53, ATM, rezistence, senzitivita, fludarabine, viability, in vitro testing, resistance, sensitivity

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 6. 2007
• Vedoucí: doc. Mgr. Martin Trbušek, Dr.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie