Development of optical biosensors for monitoring of pollutants in the environment

Mgr. Šárka Bidmanová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Zvyšující se množství potenciálně škodlivých látek uvolňovaných do životního prostředí představuje značný ekologický problém. Řada těchto kontaminantů životního prostředí jsou halogenované deriváty uhlovodíků pocházející z rozsáhlého využití v zemědělství i v průmyslu. Tyto látky jsou častými kontaminanty podzemních vod a bývají též součástí nebezpečných odpadů či výtoků ze skládek. Protože jsou velmi obtížně rozložitelné a často se vyznačují nežádoucími zdravotními účinky, je nezbytné sledovat koncentraci těchto nebezpečných látek v životním prostředí. Tradiční přístup monitorování životního prostředí je založen na vzorkování a následném transportu environmentálních vzorků do analytické laboratoře, ve které probíhají vlastní analýzy s využitím konvenčních metod jako je plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií. Tyto techniky vyžadují před vlastní analýzou extrakci a zakoncentrování vzorku. Přestože jsou chromatografické metody vysoce selektivní a přesné, nejsou obecně vhodné pro kontinuální měření in situ. Navíc jsou časově náročné, nákladné a požadují vysoce kvalifikovanou obsluhu. Proto je třeba vyvinout jednoduché a rychlé zařízení, které umožní automatickou přímou analýzu. Biosensory představují vhodnou alternativu nebo doplněk k těmto tradičním analytickým metodám. Jejich využití pro sledování kontaminantů životního prostředí je velmi slibné vzhledem k citlivosti biosensorů, jednoduché obsluze, relativně nízkým nákladům a snadnému přizpůsobení pro měření in situ. Tato disertační práce se věnuje vývoji nového enzymatického biosensoru pro detekci halogenovaných alifatických uhlovodíků v životním prostředí. Klíčovým krokem při konstrukci biosensoru je volba rozpoznávacích elementů a jejich zachycení na povrchu optického převodníku. Biosensor je založen na dehalogenační aktivitě purifikovaného enzymu halogenalkandehalogenasy LinB izolovaného ze Sphingobium japonicum UT26. Enzymatická reakce s halogenovanými uhlovodíky je doprovázena uvolněním protonů detekovatelnými změnou fluorescence pH indikátoru. U osmi fluorescenčních pH indikátorů byla stanovena jejich citlivost ke změnám pH, optimální excitační a emisní vlnová délka a srovnána jejich fluorescenční intenzita. Pro využití v biosensoru byl vybrán indikátor 5(6)-karboxyfluorescein, který byl zkonjugován s bovinním sérovým albuminem a následně detailně charakterizován. Pro imobilizaci obou rozpoznávacích elementů byly testovány různé imobilizační metody založené na zesíťování a zachycení. Sledovanými parametry u imobilizovaného pH indikátoru byla odezva na pH a vymývání molekul, u imobilizovaného enzymu bylo důležité zachování enzymatické aktivity a rovněž případné vymývání. Nejvhodnější imobilizační metoda pro oba elementy bylo zesíťování glutaraldehydem, což umožnilo tvorbu jedné citlivé vrstvy na povrchu optického převodníku. Měřicí postup byl ustanoven optimalizací doby ekvilibrace a doby měření. Byl též studován vliv různých podmínek uchovávání na odezvu biosensoru. Nově zkonstruovaný biosensor byl testován se dvěma halogenovanými alifatickými deriváty uhlovodíků, 1,2-dibromethanem a 3-chlor-2-(chlormethyl)-1 propenem, jako modelovými analyty. Byl stanoven lineární rozsah a detekční limit biosensoru pro tyto látky. Vyvinutý biosensor představuje atraktivní nástroj pro kontinuální in situ monitorování halogenovaných kontaminantů v životním prostředí. Tato disertační práce se věnuje vývoji nového enzymatického biosensoru pro detekci halogenovaných alifatických uhlovodíků v životním prostředí. Klíčovým krokem při konstrukci biosensoru je volba rozpoznávacích elementů a jejich zach

Abstract:

ycení na povrchu optického převodníku. Biosensor je založen na dehalogenační aktivitě purifikovaného enzymu halogenalkandehalogenasy LinB izolovaného ze Sphingobium japonicum UT26. Enzymatická reakce s halogenovanými uhlovodíky je doprovázena uvolněním protonů detekovatelnými změnou fluorescence pH indikátoru. U osmi fluorescenčních pH indikátorů byla stanovena jejich citlivost ke změnám pH, optimální excitační a emisní vlnová délka a srovnána jejich fluorescenční intenzita. Pro využití v biosensoru byl vybrán indikátor 5(6)-karboxyfluorescein, který byl zkonjugován s bovinním sérovým albuminem a následně detailně charakterizován. Pro imobilizaci obou rozpoznávacích elementů byly testovány různé imobilizační metody založené na zesíťování a zachycení. Sledovanými parametry u imobilizovaného pH indikátoru byla odezva na pH a vymývání molekul, u imobilizovaného enzymu bylo důležité zachování enzymatické aktivity a rovněž případné vymývání. Nejvhodnější imobilizační metoda pro oba elementy bylo zesíťování glutaraldehydem, což umožnilo tvorbu jedné citlivé vrstvy na povrchu optického převodníku. Měřicí postup byl ustanoven optimalizací doby ekvilibrace a doby měření. Byl též studován vliv různých podmínek uchovávání na odezvu biosensoru. Nově zkonstruovaný biosensor byl testován se dvěma halogenovanými alifatickými deriváty uhlovodíků, 1,2-dibromethanem a 3-chlor-2-(chlormethyl)-1 propenem, jako modelovými analyty. Byl stanoven lineární rozsah a detekční limit biosensoru pro tyto látky. Vyvinutý biosensor představuje atraktivní nástroj pro kontinuální in situ monitorování halogenovaných kontaminantů v životním prostředí.

Abstract:

The steadily increasing number of potentially harmful compounds released into the environment represents a significant ecological problem. Halogenated hydrocarbons act as one of the largest groups of environmental contaminants, mainly as a result of their extensive use in agriculture and industry. These compounds belong to prevalent groundwater contaminants and are significant components of hazardous wastes and landfill leachates. Since halogenated hydrocarbons are very resistant to degradation and have adverse health effects, their accurate monitoring in the environment is necessary. Traditionally, samples are collected in the monitored environment and sent for a laboratory analysis using conventional techniques such as gas chromatography coupled with mass spectrometry, requiring a preliminary extraction and concentration steps. Chromatographic methods are highly selective and sensitive, but are not generally suited for continuous in situ measurements. In addition, they are time-consuming, expensive and require operation by highly trained personnel. Therefore, there is a growing need to develop simple and rapid devices which are capable of automated and more direct analysis. Biosensors are analytical tools which can be an alternative or a complement to conventional techniques. Their application in environmental monitoring is very promising owing to their sensitivity, low costs, user-friendliness and adaptability for on site field measurements. This Ph.D. Dissertation is focused on development of a novel enzyme-based optical biosensor for detection of halogenated aliphatic hydrocarbons in the environment. Selection of suitable recognition elements and their attachment to the optical transducer are key steps in construction of the biosensor. The sensing concept is based on purified enzyme haloalkane dehalogenase LinB from Sphingobium japonicum UT26. The enzymatic reaction with halogenated hydrocarbons is accompanied by release of protons, which is followed by change in fluorescence of the pH indicator. Eight fluorescence pH indicators were tested and their sensitivity to pH, optimal excitation and emission wavelengths and fluorescence intensity were determined. The indicator 5(6)-carboxyfluorescein was selected for application in the biosensor. This molecule was conjugated with bovine serum albumin and its fluorescent properties were studied into detail. Different immobilization techniques, utilizing cross-linking and entrapment, were investigated for the immobilization of both recognition elements. The response to pH and the leaching potential were the most important parameters evaluated for immobilized pH indicator, while the retention of enzymatic activity and the protein leaching were monitored for immobilized haloalkane dehalogenase. The method optimal for both components was cross-linking with glutaraldehyde, which enabled formation of one sensitive layer on the optical transducer. A measuring procedure for the biosensor was established by determination of the equilibration time and the measurement time. Effect of different storage conditions on response of biosensor was also investigated. The newly constructed biosensor was validated with two halogenated aliphatic hydrocarbons, 1,2-dibromoethane and 3-chloro-2-(chloromethyl)-1-propene, as the model substrates. The linear range and the detection limit were determined. The developed biosensor is an attractive tool for continuous in situ monitoring of halogenated contaminants in the environment.

Keywords

biosensor, fluorescence, immobilization, enzyme, pH indicator, haloalkane dehalogenase, enviroment, halogenated pollutants

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 9. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 25. 9. 2012
• Supervisor: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.
• Reader: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc., Ing. Gabriela Kuncová, CSc., RNDr. Miroslav Pohanka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Environmental Chemistry