Kultury "hairy roots" řepky olejky (Brassica napus) jako nástroj pro studium funkce genů

Bc. Jan Butula

Master's thesis

Hairy root culture of oilseed rape (Brassica napus) as a tool for gene function studies

Abstract:

Studium genů řídících ontogenetické a fyziologické procesy v rostlinách bylo vždy důle-žitou součástí vědecké práce v oblasti rostlinné biologie. Tato diplomová práce se věnuje vytvoření systému pro studium promotorů. K tomuto účelu jsem vytvořil pomocí Modu-lárního klonovacího systému sérii konstruktů obsahujících 35S promotor a promotory TAA genů, které se účastní biosyntézy auxinu. V těchto konstruktech je vždy začleněna i kódující sekvence pro GUS s introny a bez intronů, jež slouží jako reportérový gen. Tě-mito konstrukty byla pomocí Agrobacterium tumefaciens s Ri plazmidem transformována modelová rostlina Brassica napus. Následné barvení transformovaných hairy roots potvr-dilo funkčnost mnou vyvinutého systému. Aby byl počet linií získaných pomocí transformace co nejvyšší, věnoval jsem se v této práci i optimalizaci samotného procesu transformace a regenerace rostlin. Tato část práce se týkala především zvýšení efektivity transformace u Brassica napus (kultivar Topas) pomocí alternace optické denzity agrobakteriálních kultur a stáří transformovaných rost-lin. Současně jsem se zabýval i zvýšením efektivity regenerace prýtů z hairy root kultur, kdy jsem testoval dopad různých koncentrací hormonů v regeneračním médiu. Také jsem optimalizoval médium pro kořenění regenerovaných prýtů. V neposlední řadě jsem se věnoval i studiu dědičnosti genů kódovaných agrobakteriálním Ri plazmidem, které byly vneseny do rostlinného genomu při transformaci.

Abstract:

The study of genes controlling ontogenetic and physiological processes in plants has always been an important part of scientific work in plant biology. This thesis deals with the development of a system for the study of promoters. To achieve this goal, I used the Modular Cloning System to create a set of constructs containing the 35S promoter and promoters of TAA genes involved in auxin biosynthesis. These constructs also include the coding sequence for GUS with and without introns, which serves as a reporter gene. The model plant Brassica napus was transformed with these constructs using Agrobacte-rium tumefaciens with the Ri plasmid. Subsequent staining of the transformed hairy roots confirmed the functionality of the system I developed. In order to maximize the number of lines obtained by transformation, in this thesis I also optimized the transformation and regeneration process. This part of the work was mainly focused on increasing the efficiency of transformation in Brassica napus (cultivar Topas) by altering the optical density of Agrobacterium cultures and by varying the age of the transformed plants. At the same time, I was also aiming to increase the regeneration effi-ciency of hairy root cultures by testing the effect of different concentrations of hormones in the regeneration medium. I also optimized the medium for rooting of regenerated shoots. Last but not least, I studied the inheritance of the genes encoded by Ri plasmid that were introduced into the genome of transformed plants via Agrobacterium.

Keywords

Kultury hairy roots, Brassica napus, Agrobacterium, TAA promotor, transformace, regenerace, modulární klonovací systém, Hairy root culture, TAA promoter, regeneration, transformation, modular cloning system

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 22. 6. 2022
• Supervisor: RNDr. Veronika Jedličková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Plant Biology / Experimental Plant Biology