Study of beta-secretase reaction by modern electromigration methods

Mgr. Jan Schejbal, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Alzheimerova choroba (AD) je celosvětově hlavní příčinou demence a představuje zásadní výzvu pro současnou společnost. V poslední desetiletích bylo zjištěno, že enzym β-sekretáza (BACE1) hraje klíčovou roli v rozvoji AD a představuje tak možný cíl léčby. Předpokládá se, že specifická inhibice BACE1 může zpomalit, nebo přímo zastavit, rozvoj AD. Potřeba efektivních a spolehlivých metod pro testování inhibičního potenciálu vyvíjených léčiv proti BACE1 je tudíž zřejmá. Kapilární elektroforéza (CE) je analytická metoda, která si opět získává pozici standardní techniky v bioanalytických aplikacích. CE umožňuje rychlé, efektivní a plně automatizovatelné analýzy za minimální spotřeby vzorků a dalších reagencií, aniž by vyžadovala značení analytů. CE tak představuje zajímavou alternativu k běžně používaným FRET metodám, které potřebují fluorescenčně značené substráty BACE1, což má za následek vysokou cenu a náchylnost k falešně pozitivním i negativním výsledkům. CE může být použita v několika pracovních módech, včetně jednoduchého offline a řady online uspořádání, které jsou vhodné pro automatizaci a aplikace vyžadující vysokou vzorkovací kapacitu. Aplikace těchto módu pro studium BACE1 tak představuje nosné téma této disertační práce. Získané výsledky přinesly řadu nových poznatků jak v oblasti kinetických and inhibičních studií BACE1, tak v oblasti základního výzkumu CE pro enzymová stanovení, a to zejména v případě plně integrovaných reaktorů z imobilizovaných enzymů.

Abstract:

Alzheimer’s disease (AD) is the leading cause of dementia worldwide and represents a major challenge for modern society. In last decades the enzyme β-secretase (BACE1) has been recognized as a key player in the AD pathogenesis and a putative drug target. It has been postulated that specific inhibition of BACE1 may slow down or even stop the AD progression. Therefore, the need for efficient and reliable methods to test the inhibitory potential of drug candidates on BACE1 is eminent. Capillary electrophoresis (CE) is an analytical technique which is regaining its position as a standard tool for bioanalysis. It offers fast, highly efficient and fully automatable analyses with minuscule sample and reactants consumption and no need for analyte labelling. Thus, CE represents an interesting alternative to commonly applied FRET assays, which require the use of fluorescently labelled substrates of BACE1 and therefore are relatively costly and prone to false positive and negative results. CE can be applied in various modes of operation, including simple offline and numerous online setups suitable for automation and high-throughput applications. The applicability of those modes to BACE1 kinetic and inhibition studies, thus represents the principal topic of this thesis. The acquired results brought several new insights not only to BACE1 kinetic and inhibition studies but also to the basic research regarding CE application for enzyme assays with the special focus on fully integrated immobilized enzyme reactors.

Keywords

capillary electrophoresis, beta-secretase, enzyme kinetics, inhibition assay, online assay, immobilized enzyme reactor, magnetic particles, kapilární elektroforéza, beta-sekretáza, enzymová kinetika, inhibiční studie, online reakce, imobilizovaný enzymový reaktor, magnetické částice

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 9. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 19. 10. 2018
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D., prof. Ing. Ivan Mikšík, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry