Hodnocení vlivu sanace chlorovaných etylenů na původní mikrobiální společenstva pomocí nástrojů molekulární biologie

Mgr. Marie Czinnerová

Doctoral thesis

Abstract:

Tato práce se soustředí na hodnocení vlivu sanačního zásahu na složení mikrobiálního společenstva a jeho změny v čase a sleduje přítomnost degradačních enzymů důležitých pro dekontaminaci polutantů. Soustředí se na rozklad chlorovaných etylenů, které představují jedny z nejrozšířenějších kontaminantů podzemních vod. Sleduje skupiny bakterií, které jsou schopny degradovat chlorované etyleny (tzv. organohalid-respirující bakterie; OHRB), a také geny kódující enzymy metabolických drah degradace těchto látek. Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) z podzemní vody byla komplikovaná pro vysoký obsah chlorovaných etylenů ve vzorcích, proto musel být extrakční protokol optimalizován a ověřen pro každou studovanou lokalitu. Pomocí metody polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qPCR) byly následně detetekovány OHRB a specifické bakteriální geny v jednotlivých vzorcích. qPCR primery pro jejich detekci musely být otestovány pro co největší selektivitu a reakční podmínky optimalizovány pro každý vzorek zvlášť kvůli přítomnosti inhibitorů ve vzorcích. Změny ve složení a zastoupení přítomných bakteriálních populací byly dále sledovány metodou 16S rRNA amplikonové sekvenace, pomocí které lze detailně popsat složení celého autochtonního bakteriálního společenstva. Bylo zjištěno, že aplikace činidel pro cílenou oxidaci (peroxid vodíku pro spuštění Fentonovy reakce) a redukci (nulmocné nanoželezo v kombinaci s aplikací elektrického napětí a nulmocné železo uchycené v aktivním uhlí) chlorovaných etylenů mohou způsobit pokles v hladinách sledovaných degradačních bakterií. Tento pokles je však pouze dočasný a po krátké době dochází k obnovení populací OHRB díky vhodně nastaveným sanačním podmínkám a v některých případech i k podpoře jejich růstu. Aplikace biostimulačních substrátů laktátu sodného a glycerolu podpořila růst OHRB na kontaminovaných lokalitách. Pomocí sekvenační analýzy bylo také zjištěno, že po aplikaci glycerolu došlo primárně k proliferaci glycerol-fermentujících bakterií, které produkují zdroj uhlíku (acetát) a elektronů (molekulární vodík; H2) pro růst OHRB, současně se také zvýšily hladiny degradačních enzymů. Došlo i ke snížení oxidačně-redukčního potenciálu podzemní vody na hodnoty vhodné pro růst sulfát a železo-redukujících bakterií, které sice kompetují s OHRB o zdroj elektronů, ale současně produkují kofaktory enzymů důležité pro jejich růst. Tato dizertační práce ukázala, že pro úspěšnou dekontaminaci chlorovaných etylenů je nezbytné před sanačním zásahem co nejlépe charakterizovat vybranou lokalitu, a to jak z hydrochemického hlediska, tak za pomoci metod molekulární biologie, protože OHRB i další bakterie, které fungují jako primární či sekundární "čističi" lokality, potřebují k úspěšnému růstu a práci nejen určité environmentální podmínky, jako je vhodný oxidačně-redukční potenciál, pH, koncentrace rozpuštěného kyslíku, sulfátů či nitrátů, ale také dostatek živin, zdroj elektronů, a v neposlední řadě se ukázalo, že i celé bakteriální společenstvo poskytující dostatek syntropních interakcí. V monitoringu přítomných degradačních bakterií a jejich enzymů je třeba pokračovat v průběhu celého sanačního zásahu, aby bylo možné ve správný čas znovu podpořit optimální biodegradaci.

Abstract:

This study assessed the effect of different remediation techniques on microbial community composition in the treated area and its changes over time. The research focused on sites polluted by chlorinated ethenes (CEs), one of the most common groundwater contaminants. The presence of organohalide-respiring bacteria (OHRB) capable of CE degradation was monitored along with the genes encoding enzymes of their degradation pathways. Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) from groundwater samples was challenging due to high concentration of CEs. As such, DNA extraction protocol had to be optimized and verified for each site studied. Furthermore, all primers for the detection of OHRB and specific genes had to be tested for their accuracy before standard use in real-time polymerase chain reaction (qPCR) and all qPCR reactions optimized due to the presence of inhibitors in the samples. Changes in the composition of the bacterial community and the shifts in selected populations were further analysed by the 16S rRNA amplicon sequencing, which was used to describe the composition of the whole autochthonous bacterial community in detail. The application of reagents for oxidation (hydrogen peroxide to trigger the Fenton-like reaction) and reduction (nanoscale zero-valent iron in combination with electrokinetic treatment and zero-valent iron attached to activated carbon) of chlorinated ethenes caused a decrease in the levels of degrading bacteria. However, this effect was only temporary and, after a short time, OHRB populations recovered due to the inflow of untreated water and well-adjusted and favorable soil conditions during remediation. The application of biostimulation substrates sodium lactate and glycerol supported the growth of OHRB at the contaminated site. 16S rRNA sequencing also showed that glycerol-fermenting bacteria, which produce an essential source of carbon (acetate) and electrons (molecular hydrogen; H2) for OHRB growth, were the first to proliferate after glycerol application, followed by OHRB. Levels of degradation enzymes also increased. Oxidation-reduction potential of the groundwater was reduced after the application to levels suitable for the growth of sulfate and iron-reducing bacteria, which compete with OHRB for electron source but also produce enzyme cofactors essential for their growth. This thesis demonstrates the importance of autochthonous microbial community characterization of the polluted site before and during remediation for successful CE decontamination. OHRB and other bacteria that act as primary or secondary "cleaners" of a remediated site need not only certain soil conditions for successful growth, such as suitable oxidation-reduction potential, pH, dissolved oxygen, sulfate, or nitrate concentration, but also sufficient supply of nutrients and electron sources. Last but not least, it was revealed that besides OHRB, a whole bacterial community providing sufficient syntrophic interactions is very important for CE degradation. Monitoring of degrading bacteria and their enzymes should be continued throughout the whole remediation action to support optimal biodegradation rates at the right time.

Keywords

remediace, chlorované etyleny, organohalid-respirující bakterie, metody molekulární biologie, bakteriální komunita, biodegradace

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 1. 2022

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Alena Ševců, Ph.D.

Technical University of Liberec

Faculty of Mechatronics, Informatics and Interdisciplinary Studies

Doctoral programme / field:
Applied Sciences in Engineering / Applied Sciences in Engineering