Detekce strukturních variant u pacientů s mnohočetným myelomem metodou optického mapování

Bc. Jiřina MAŇÁKOVÁ

Master's thesis

Detection of structural variants in pacients with multiple myeloma by optical mapping

Abstract:

Mnohočetný myelom (MM) je druhé nejčastěji se vyskytující hematologické onemocnění. Je charakterizováno klonální proliferací maligních B buněk a jejich nekontrolovanou diferenciací v myelomové buňky v kostní dřeni. V patogenezi tohoto onemocnění hrají významnou roli genetické abnormality, které ovlivňují vývoj onemocnění, mají vliv na prognózu a také na terapeutickou odpověď. V současné době jsou pro rutinní diagnostiku chromozomových aberací u mnohočetného myelomu používány tradiční cytogenetické metody (stanovení karyotypu, FISH nebo arrayCGH). V této práci byla pro detekci chromozomových změn u MM testována nová metoda optického mapování, která umožňuje studium strukturních a početních variant v celém genomu v podobě delecí, inzercí, duplikací, inverzí a translokací včetně změn v počtu kopií chromozomů v rozsahu stovek kbp, které současné metody nejsou schopny detekovat. První část experimentální práce byla věnována optimalizaci separace myelomových buněk s cílem nalézt vhodnou separační metodu pro získání populace plazmatických buněk v dostatečné čistotě a množství pro metodu optického mapování. V neposlední řadě byla také optimalizována izolace vysokomolekulární DNA z myelomových buněk kostní dřeně a srovnány metody fluorescenčního značení vysokomolekulární DNA. V další části byla využitelnost metody optického mapování pro detekci chromozomových změn prezentována na analýze pěti vybraných vzorků kostní dřeně nově diagnostikovaných pacientů s MM. Ze separovaných myelomových buněk byla izolována vysokomolekulární DNA, která byla specificky fluorescenčně značena pomocí DLS chemie a vizualizována systémem Saphyr (BionanoGenomics). Poté byly sestaveny genomové mapy a porovnány s referenčním genomem (hg38) na základě značených specifických sekvenčních motivů. Nakonec byly nalezené strukturní variace (SV) porovnány s databází zdravých jedinců a byly analyzovány pouze de novo SV. Výsledky optického mapování byly srovnány s nalezenými chromozomovými změnami pomocí cytogenetických analýz. Metoda optického mapování potvrdila všechny strukturní změny detekované standardními cytogenetickými metodami. Kromě těchto změn byly u všech pacientů nalezeny další de novo strukturní abnormality. Převážná část nalezených SV byly delece (60 %), dále byly detekovány nové translokace, z nichž většina byla intrachromozomální (64 %) na chromozomech 3, 4, 6, 14, 16, 17 a 18. Interchromozomální translokace (36 %) zahrnovaly chromozomy 2, 8, 3, 6, 12, 17 a 22. U všech vzorků byly také nalezeny de novo SV na chromozomu 17. Naše výsledky ukazují, že nová technologie optického mapování má potenciál pro detekci chromozomových abnormalit v takovém rozsahu, který běžně dostupné metody neumožňují. Tyto nově nalezené strukturní změny by mohly vést k lepšímu pochopení variability genomu a také ovlivnit klinickou prognózu nebo odpověď na terapii u pacientů s MM.

Abstract:

Multiple myeloma (MM) is the second most common haematological disease. It is characterized by clonal proliferation of malignant B cells and their uncontrolled differentiation in myeloma cells in the bone marrow. The genetic abnormalities play a critical role in the pathogenesis of this disease by affecting the progression of the desease, its prognosis and the therapeutic response. Nowadays, karyotype and FISH or arrayCGH have been standard diagnostic tools for detection of chromosomal aberations in multiple myeloma. In diploma thesis, a new method of optical mapping has been tested for the detection of chromosomal changes in multiple myeloma, which allows the study of structural variants of the whole genome in the form of deletions, insertions, duplications, inversions and translocations, including changes in copy number variations (CNV) in the hundreds of kbp range that the current methods are unable to detect. The first part of the thesis was devoted to optimizing the myeloma cells separtion in order to find a suitable separation method for obtaining a plasma cell population in sufficient purity and amount for the optical mapping method. Last but not least, the isolation from bone marrow myeloma cells was optimized, and the methods of the fluorescence labeling of high molecular weight DNA were compared. In the next part of the thesis, the useability of the optical mapping method for the detection of chromosomal changes was presented on the analysis of five bone marrow samples from newly diagnosed MM patients. High molecular weight DNA was isolated from the separated myeloma cells, specifically labeled with DLS chemistry and visualized using Saphyr system (BionanoGenomics). Genomic maps were then assembled as compared to the reference genome (hg38) based on known labeled specific motifs. Finally, the found SVs were compared with the database of healthy individuals and analyzed only de novo SV. The results of optical mapping were compared with the found chromosomal changes by cytogenetic analyzes. The optical mapping method confirmed all structure changes detected by standard cytogenetic methods. In addition to these changes, all de novo structural abnormalities were found in all patients. The vast majority of SV were deletions (60 %), new translocations were detected, most of which were intrachromosomal (64 %) on chromosomes 3, 4, 6, 14, 16, 17 and 18. Interchromosomal translocation (36 %) included chromosomes 2, 8, 3, 6, 12, 17 and 22. De novo SV on chromosome 17 was also found in all samples. Our results show that the new technology of optical mapping has the potential to detect large SV unidentifiable by commonly used methods. These newly found structural changes could lead to a better understanding of genome variability and also affect clinical prognosis or response to therapy in MM patients.

Keywords

Mnohočetný myelom, optické mapování, strukturní změny, genetické abnormality, translokace, delece, změny v počtu kopií chromozomů

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 28. 5. 2019
• Supervisor: Ing. Regina Fillerová, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry