Monitorování biotransformace methotrexátu u onkologických pacientů s využitím kapalinové chromatografie

Mgr. Michal Řiháček

Advanced ('rigorózní') thesis

Therapeutic drug monitoring of methotrexate biotransformation in patients with malignancy by liquid chromatography

Abstract:

Rigorózní práce se věnuje zavádění separační metody analýzy methotrexátu a metabolitů na bázi ultra vysokoúčinné kapalinové chromatografie se spektrofotometrickou detekcí do klinické praxe, jako alternativy automatizovaných imunoanalytických technik, které mohou selhávat v poskytování spolehlivých výsledků v přítomnosti interferujících metabolitů. Práce definuje validační parametry a kontrolu kvality separační metody stanovení methotrexátu a jeho hlavního metabolitu 7-hydroxymethotrexátu v klinické laboratoři. Chromatografické podmínky byly upraveny a nastaveny tak, aby bylo v budoucnu možné kvantifikovat i další metabolity, včetně intracelulárních polyglutamátů methotrexátu, s použitím citlivější instrumentace – hmotnostní spektrometrie. Pomocí nově zavedené metody bylo na Oddělení laboratorní medicíny Masarykova onkologického ústavu změřeno celkem 85 vzorků krevní plasmy dětských onkologických pacientů. Byly hodnoceny naměřené hodnoty zejména potenciálně nefrotoxického a hepatotoxického metabolitu 7-hydroxymethotrexátu a to ve vztahu k jednotlivým diagnózám. Práce obsahuje podrobně popsanou kasuistiku pacienta se závažnou nefrotoxicitou, která mohla souviset s prodlouženým uvolňováním tohoto metabolitu. V rámci in vitro studií účinků methotrexátu na nádorové buňky bylo pomocí nově validované metody analyzováno také celkem 36 vzorků osteosarkomových buněčných linií a kultivačních médií.

Abstract:

In this thesis, we introduce novel ultra high performance liquid chromatography-based separation technique for analysis of methotrexate and metabolites in blood plasma as an alternative to automated methotrexate immunoassays that may fail to provide reliable results in samples with the presence of interfering metabolites. We define validation process and internal quality control, that we employed during implementation of the novel method to clinical practice. Chromatographic conditions were optimised for future mass spectrometry assay of other methotrexate metabolites such as intracelular methotrexate polyglutamates. The method was succesfully applied on 85 blood plasma samples od pediatric patients with various malignancies. We focused on evaluation of 7-hydroxymethotrexate concentrations as potentialy nephrotoxic and hepatotoxic metabolite. We also describe a case of a patient with severe nephrotoxicity and prolonged elimination of7-hydroxymethotrexate. Concommitantly, we measured methotrexate concentration in 36 samples of three different methotrexate treated osteosarcoma cell lines and in their respective growth media.

Keywords

methotrexát, biotransformace, chromatografie, spektrofotometrie, osteosarkom, akutní lymfoblastická leukémie, methotrexate, biotransformation, chromatography, spectrophotometry, osteosarcoma, acute lymphoblastic leukemia

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 9. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 26. 1. 2016
• Reader: Ing. Drahomíra Springer, Ph.D., Mgr. Zdenka Fohlerová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Advanced ('rigorózní řízení') programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry