Structural and interaction study of MEG family proteins and their role in liver fibrosis onset

Ing. Štěpánka Nedvědová

Doctoral thesis

Abstract:

MEG proteiny jsou unikátními pro parazitické trematody, primárně pro lidského parazita Schistosoma mansoni. Tyto proteiny jsou kódovány tzv. micro-exon geny, které mají jedinečnou strukturu sestávající z krátkých mikro-exonů střídajících se s dlouhými introny. Sekvenováním genomu S. mansoni bylo identifikováno 35 genů kódujících 87 ověřených MEG proteinů. Tyto geny nevykazují žádnou homologii k jiným anotovaným genům s výjimkou genů nalezených u Schistosoma spp. Navíc postrádají identifikovatelné motivy a známé funkční domény. MEGs podléhají alternativnímu sestřihu, což vede k vzniku velké variability proteinů díky vytvoření vícero isoforem z jedné mRNA. Většina MEG rodin má několik členů, z nichž většina má vícero splice isoforem, což umožňuje S. mansoni produkovat různorodou škálu proteinů v závislosti na vnitřním prostředí lidského hostitele. Transkriptomické studie naznačují, že MEG proteiny by se mohly podílet i na interakcích mezi hostitelem a parazitem, zejména při prostupu zralých vajec střevní stěnou. Tyto proteiny mají jedinečnou (nehomologní) strukturu se signálním peptidem na N-konci, což naznačuje jejich sekreci. Kromě toho většina MEG proteinů obsahuje významné množství cysteinových reziduí a předpokládá se u nich vnitřně neuspořádaná struktura (IDP). Navzdory jejich velmi zajímavé povaze, pro MEG proteiny bylo dosud provedeno jen málo studií zkoumajících jejich biofyzikální vlastnosti. Pouze několik publikací se zaměřilo na transkriptomické a lokalizační analýzy; ještě méně publikací bylo věnováno jejich strukturní a funkční charakterizaci. Cílem této disertační práce je proto zaplnit tuto mezeru a zaměřit se na trojici MEG proteinů – MEG 2.1, MEG 3.2 a MEG 6, které byly identifikovány ve vajíčkách S. mansoni. Za účelem strukturních studií MEG proteinů byla testována řada expresních systémů a různých podmínek expresí pro získání rekombinantních proteinů. Bohužel se navzdory velkému úsilí nepodařilo získat žádný ze tří proteinů MEG v relevantním množství pro NMR analýzy. MEG 6 nebyl exprimován vůbec a MEG 2.1 isoforma 1 vykazoval ve zvoleném expresním systému značnou nestabilitu. MEG 3.2 isoforma 1 byl úspěšně exprimován pomocí specifického protokolu pro expresi toxických proteinů v bakteriálním systému, ale nepodařilo se dosáhnout požadované koncentrace ať neznačeného nebo značeného proteinu. Navíc i tato isoforma vykazovala problémy se stabilitou. Vzhledem k problémům při expresích rekombinantních proteinů byla použita strategie "rozděl a znovu sestav". Krátké peptidy odpovídající isoformám 1, 2 a 3 MEG 2.1 proteinu, byly syntetizovány chemicky. Tyto peptidy však nebylo možné rozpustit v biologicky relevantních pufrech nebo organických rozpouštědlech. K překonání tohoto problému byl pro NMR měření použit deuterovaný dimethylsulfoxid (DMSO-d6), zatímco acetonitril (také ve směsi s trifluorethanolem) byl použit za účelem analýz pomocí cirkulárního dichroismu (CD). NMR experimenty byly prováděny na syntetizovaných peptidech pomocí homonukleárních a heteronukleárních technik. Peptidy byly měřeny v přirozeném zastoupení izotopů 1H, 13C a 15N, což vedlo ke značně dlouhým dobám analýz. Následně byly provedeny strukturní výpočty pomocí softwaru CYANA. Rekonstruovaná a minimalizovaná MEG 2.1 isoforma 1 vykazovala během simulací molekulární dynamiky tvorbu krátkých a dlouhých šroubovic. Dále byla provedena fylogenetická analýza, klasifikace MEG proteinů na základě primární struktury a ab initio strukturní predikce. Cílem této disertační práce bylo prostřednictvím kombinace biochemických, biofyzikálních a bioinformatických analýz charakterizovat málo prozkoumané MEG proteiny sekretované vejci S. ma

Abstract:

nsoni. MEG 2.1 je díky této práci jedinou MEG rodinou, u níž byly strukturně popsány všechny splice varianty. Celkově tato studie přispívá k pochopení rozmanitosti MEG proteinů a poskytuje základ pro budoucí výzkum jejich funkčního významu v interakcích mezi hostitelem a parazitem.

Abstract:

MEG proteins are unique to parasitic trematodes, particularly Schistosoma mansoni. These proteins are encoded by micro-exon genes, which have a unique structure consisting of short micro-exons alternated by long introns. Through genome sequencing of S. mansoni, 35 genes encoding 87 verified MEG proteins were identified. These genes show no similarity to other annotated genes except those found in Schistosoma spp. Furthermore, they lack identifiable motifs or functional domains. MEGs undergo alternative splicing, resulting in the generation of multiple isoforms from a single mRNA. Most MEG families have several members, each with several spliced isoforms, enabling S. mansoni to produce a diverse range of proteins based on the internal environment of the human host. Transcriptomic studies have suggested that MEG proteins are involved in host-parasite interactions, particularly in the penetration of eggs through the intestinal wall. These proteins exhibit a unique structure with a signal peptide at the N-terminus, indicating their secretion. Additionally, MEG proteins often contain a significant amount of cysteine residues and are predicted to have a disordered protein structure (IDP). Despite the intriguing nature of MEG proteins, there have been limited studies investigating their biophysical properties. Only a few publications have focused on transcriptomic and localization analyses, with even fewer dedicated to their structural and functional characterization. Therefore, the current dissertation aims to address this knowledge gap by focusing on a trio of MEG proteins—MEG 2.1, MEG 3.2, and MEG 6—that have been identified in S. mansoni eggs. To study the MEG proteins, various expression systems, and conditions were tested to obtain recombinant proteins for structural analyses. Unfortunately, despite extensive efforts, none of the three MEG proteins were obtained in sufficient quantities for NMR analysis. MEG 6 protein was not expressed at all, while MEG 2.1 isoform 1 showed instability in the selected expression system. MEG 3.2 isoform 1 was successfully expressed using a specific protocol for toxic protein expression in a bacterial system, but the required concentration of both unlabeled and labeled protein for NMR analysis could not be achieved. Additionally, MEG 3.2 isoform 1 exhibited stability issues. Given the challenges in recombinant protein expression, a "divide and reconstruct" strategy was employed. Short peptides corresponding to isoforms 1, 2, and 3 of MEG 2.1 were chemically synthesized. However, these peptides posed solubility issues in biologically relevant buffers and organic solvents. To overcome this, 100% deuterated dimethyl sulphoxide (DMSO-d6) was used for NMR measurements, while acetonitrile (also mixed with trifluoroethanol) (TFE) were tested as suitable solvents for circular dichroism (CD) analyses. NMR experiments were performed on the synthesized peptides using homonuclear and heteronuclear techniques. The peptides were measured at natural abundance, resulting in lengthy analysis times. Subsequently, structural calculations using CYANA software were conducted. The reconstructed and minimized isoform 1 of MEG 2.1 exhibited the formation of short and long helices during molecular dynamics simulations. Additionally, phylogenetic analysis, classification based on primary structure, and ab initio structural predictions were performed. Through a combination of biochemical, biophysical, and bioinformatic analyses, this dissertation aimed to characterize the poorly studied egg-secreted MEG proteins. Notably, MEG 2.1 remains the only MEG family for which all splice variants have been structurally described. Overall, this study contributes to the understanding of MEG protein diversity and provides a foundation for future investigations into their functional significance in host-parasite interactions.

Keywords

S. mansoni, MEG, NMR

Keywords

Schistosoma mansoni, MEG proteins, NMR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 8. 2023

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Matyáš Orsák, Ph.D.
• Reader: Christina Sizun, externi, Sonia Longhi, externi, Frederic Vellieux, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme:
Agricultural Chemistry