Vliv povrchových modifikací lipidových nanočástic na jejich vlastnosti

Bc. Vendula Mašková

Master's thesis

Effect of surface modifications of lipid nanoparticles on their properties

Abstract:

Cílem diplomové práce bylo studovat vliv povrchových úprav lipozomálních nanočástic na jejich fyzikálně-chemické vlastnosti a zhodnocení jejich příjmu buňkami in vitro. Za tímto účelem byly pro srovnání připraveny dva typy lipozomálních nanočástic (LNPs), které se lišily rozdílnou citlivostí ke změnám pH, tedy pH senzitivní LNPs, které ve svém složení obsahují lipid CPA (cholesteryl-PEG350-aminoxylipid), na nějž se oximovou vazbou navázal PEG (propionaldehyd polyethylenglykolu), a pH nesenzitivní LNPs obsahující DSPE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin-polyethylenglykolem). Do těchto nanočástic byla enkapsulována siRNA a byla studována stabilita při skladování, pH senzitivita, štěpení pH senzitivní vazby, formace proteinové korony a jejich pohlcování buňkami HepG2. S použitím hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF byla při snižování pH ověřena pH senzitivita vazeb mezi PEGem a CPA, případně mezi PEGem a DSPE. Při studiu pH senzitivity byla také sledována velikost nanočástic, PDI a zeta potenciál. Dle výsledků se pH nesenzitivní LNPs skutečně jevily jako inertní vůči změně pH a pH senzitivní LNPs vykazovaly změny v parametrech při pH 6,0. Dále byla posuzována stabilita obou typů LNPs při dlouhodobém skladování za rozdílných teplotních podmínek na základě změny velikosti a PDI. Připravené LNPs se po celou dobu experimentu i při různých teplotách jevily jako velikostně uniformní a stabilní. Výjimkou byly LNPs s fluorescenčním značením, které v rámci sledovaných parametrů vykazovaly horší stabilitu. V neposlední řadě byl potvrzen vliv povrchových modifikací na snížení tvorby proteinových koron. Připravené LNPs taktéž efektivně vstupovaly do buněk a do 24 hodin došlo k uvolnění siRNA do cytoplazmy z pH senzitivních LNPs a pravděpodobné akumulaci siRNA v endozomech v případě pH nesenzitivních LNPs. Na základě výsledků práce lze usuzovat, že připravené pH senzitivní LNPs vykazují žádoucí chování v biologických systémech, a tudíž mají potenciál jako vhodný nosič pro dopravu siRNA v rámci biologických aplikací.

Abstract:

The aim of the thesis was to study the effect of surface modifications of liposomal nanoparticles on their physicochemical properties and to evaluate their uptake by cells in vitro. For this purpose, two types of liposomal nanoparticles (LNPs) that differed in their sensitivity to pH changes, i.e. pH-sensitive LNPs containing the lipid CPA (cholesteryl-PEG350-aminoxylipid) in their composition, were prepared for comparison, to which PEG (polyethylene glycol propionaldehyde) was attached by an oxime bond, and pH-insensitive LNPs containing DSPE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-polyethylene glycol). The siRNAs were encapsulated into these nanoparticles and the storage stability, pH sensitivity, cleavage of pH-sensitive linkage, protein corona formation and their uptake by HepG2 cells were studied. The pH sensitivity of the linkages between PEG and CPA, or between PEG and DSPE, was verified using MALDI-TOF mass spectrometry at decreasing pH. Nanoparticle size, PDI and zeta potential were also monitored during the pH sensitivity study. According to the results, pH insensitive LNPs indeed appeared to be inert to pH change and pH sensitive LNPs showed changes in parameters at pH 6.0. Furthermore, the stability of both types of LNPs during long-term storage under different temperature conditions was assessed based on the change in size and PDI. The prepared LNPs appeared to be size uniform and stable throughout the experiment even at different temperatures. The exceptions were the fluorescently labelled LNPs, which exhibited poorer stability within the parameters studied. Finally, the effect of surface modifications on the reduction of protein corona formation was confirmed. The prepared LNPs also efficiently entered the cells, and within 24 hours there was a release of siRNA into the cytoplasm from pH-sensitive LNPs and a probable accumulation of siRNA in endosomes in the case of pH-insensitive LNPs. Based on the results of this work, it can be concluded that the prepared pH-sensitive LNPs exhibit desirable behavior in biological systems, and thus have potential as a suitable carrier for siRNA transport in biological applications.

Keywords

siRNA, PEGylace, stabilita, pH senzitivita, endocytóza, lipozomální nanočástice, oximová vazba, proteinová korona

Keywords

oxime binding, siRNA, PEGylation, pH sensitivity, protein corona, liposomal nanoparticles, stability, endocytosis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 31. 5. 2023
• Supervisor: doc. Mgr. Zbyněk Heger, Ph.D.
• Reader: Barbora Tesařová, externi

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Master programme / specializace:
Molecular Biology and Biotechnology / Animal Molecular Biology and Biotechnology