Význam minimální reziduální choroby u solidních nádorů

Josef Srovnal

Doctoral thesis

Significance of Minimal Residual Disease in Patients with Solid Tumors

Abstract:

Minimální reziduální choroba u solidních tumorů, detekovaná ať již ze vzorků krve, kostní dřeně nebo lymfatických uzlin, je předmětem výzkumu již několik let. Pro její detekci se stále častěji využívají molekulárně-biologické metody vyznačující se vysokou citlivostí, zejména metody založené na principu PCR. Za vysokou citlivostí však poněkud pokulhává specificita jednotlivých markerů používaných pro detekci okultních nádorových buněk. Prvním cílem předkládané práce bylo zavést a optimalizovat metodu QRT-PCR pro detekci MRD u solidních tumorů. Byla provedena kompletní validace metody včetně stanovení senzitivity a specificity. Jako markery pro detekci MRD u kolorektálního karcinomu byly vybrány CEA a CK20, pro karcinom prsu poté CEA, MGB1 a CK19. Vybrané markery se vyznačují vysokou senzitivitou a specificitou. Dále jsme se zaměřili na identifikaci nových potencionálních markerů s využitím metody DNA microarrays. V souboru vzorků karcinomu prsu byly identifikovány diferenciálně exprimované geny kódující proteiny EMPI (Epithelial membrane protein 1), DVLI (Dishevelled, dsh homolog 1), DDRI (Discoidin domain receptor family, member 1) umožňující rozlišení lobulárního a duktálního karcinomu. Význam přítomnosti MRD u pacientů se solidními tumory byl analyzován u pacientů s karcinomem tlustého střeva a konečníku a u pacientek s karcinomem prsu. Naše studie prokázala, že přítomnost MRD v periferní venózní krvi a kostní dřeni u nemocných s kolorektálním karcinonem zjištěná metodou QRT-PCR pro znaky CEA a CK20 je nezávislým negativním prognostickým znakem a identifikující rizikové pacienty, které dle dnešních kritérií řadíme do potenciálně časných stádií kurabilních lokální léčbou. Prokázali jsme také negativní prognostickou hodnotu MRD v kostní dřeni pacientek s karcinomem prsu a jasný trend ke kratšímu DFS u pacientek s MRD pozitivitou sentinelových uzlin. QRT-PCR metodou pro CEA, EpCAM a GAPDH byl sledován mechanismus účinku 4-arylazo-3,5-diamino-1H-pyrazolu. Byla zjištěna výrazná inhibice transkripce, následnými analýzami byl potvrzen výrazný inhibiční účinek na cyklin-dependentní kinázu 9. Uvedená metoda expresní analýzy tak byla využita pro studium molekulárního účinku protinádorových léčiv. Detekce MRD metodou QRT-PCR představuje účinný nástroj v klinické onkologii, který svým přínosem v oblasti ultrastagingu znamená zpřesnění diagnostiky a následné léčby onkologicky nemocného pacienta v duchu ?správná léčba, správnému pacientovi, ve správnou chvíli?. Pro definitivní zhodnocení a zařazení vyšetření MRD do algoritmu rozhodování o podání adjuvantní léčby pacientům s kurabilním karcinomem bude potřeba delšího sledování větších souborů pacientů

Abstract:

Minimal residual disease detection in blood, bone marrow and lymph nodes in patients with solid tumors is being investigated for several years, and the PCR based methods are the most useful techniques for MRD detection due its high sensitivity and specificity. Optimizalization of QRT-PCR method for MRD detection was the first objective of this work. Complete validation of methods including determination of sensitivity and specificity was successfully performed. CK20 and CEA were selected as markers for the detection of MRD in colorectal cancer, while CEA, CK19 and MGB1 were used in breast cancer. Selected markers were typical of high sensitivity and specificity. Another part of the study was focused on identification of novel specific biomarkers for breast cancer with potential use as biomarkers for MRD detection. We used microarrays method to analyze differentially expressed genes in breast cancer (ductal versus lobular subtypes) and the proteins EMPI (Epithelial membrane protein 1), DVLI (Dishevelled, dsh homolog 1), DDRII (Discoidin domain receptor family, member 1) were specifically identified. These proteins allow discrimination of lobular and ductal breast cancer. Due to tumor specific expression profiles, the MRD markers can be used also for differential diagnosis of metastases and effusions of unknown origin. Performed histopathological and immunohistochemical examinations sometimes don?t lead to determining the primary origin of metastases. In such cases it is possible to use molecular-biological methods based on the PCR principle. The significance of MRD was analyzed in two patients cohorts with colorectal and breast cancer. Our study showed that the presence of MRD in peripheral venous blood and bone marrow in patients with colorectal cancer using QRT-PCR for CEA and CK20 is an independent negative prognostic factor identifying patients at high risk of disease recurrence. We demonstrated a poor prognosis of breast cancer patients with MRD presence in the bone marrow and a clear trend towards shorter DFS in patients with MRD positive sentinel lymph nodes. Moreover, QRT-PCR method for CEA, EpCAM and GAPDH was used for identification the mechanism of action of potential anticancer drugs 4-arylazo-3 ,5-diamino-1H-pyrazole. There was found significant inhibition of transcription, subsequent analysis had confirmed a significant inhibitory effect on cyclin-dependent kinase 9. The presented study shows, that the detection of MRD in solid tumors is an effective tool in clinical oncology, which contributes to the more precise diagnosis and subsequent treatment of cancer patient in the spirit of ?The right treatment to the right patient at the right time?. However, for the final evaluation and inclusion of MRD testing into the standard diagnostic algorithm of early cancer patients we will need a more extensive studies

Keywords

minimální reziduální choroba, cirkulující nádorové buňky, polymerázová řetězová reakce, karcinom tlustého střeva a konečníku, karcinoembryonální antigen, mamaglobin, prognostický faktor

Keywords

minimal residual disease, circulating tumor cells, polymerase chain reaction, colorectal cancer, breast cancer, carcinoembryonic antigen, mamaglobin, prognostic factor

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 10. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 14. 4. 2010
• Reader: Marek Svoboda, Jiří Klein

Univerzita Palackého

Lékařská fakulta

Doctoral programme / field:
Pediatrie (čtyřleté) / Pediatrie (čtyřleté)