Nádorová heterogenita u kolorektálního karcinomu – analýza mutačního stavu genů u metastazujícího onemocnění

Bc. Šárka Rathouzská

Diplomová práce

Tumor heterogeneity of colorectal cancer - Analysis of gene mutation status in metastatic disease

Anotace:

V současné době je před nasazením cílené anti-EGFR léčby u pacientů s metastazujícím kolorektálním karcinomem rutinně vyšetřován mutační stav genů KRAS a NRAS. Podmínkou pro nasazení anti-EGFR terapie je nemutovaný stav RAS genů. Nicméně se ukazuje, že vyšetření jednoho nebo dvou markerů není dostačující pro potřebnou specifikaci pacientů. Výhodou metody sekvenování nové generace je testování více biomarkerů současně, kvantifikace biomarkerů přítomných v nádoru a v neposlední řadě úspora biologického materiálu. Vyšetřovaným materiálem byla DNA izolovaná z FFPET vzorků u tří souborů pacientů. Soubor pacientů I obsahoval 5 pacientů, u kterých byl testován mutační stav KRAS genu v bakalářské práci. Do souboru pacientů II bylo zařazeno 16 pacientů. Hlavním kritériem pro jejich výběr byla velikost nádoru (>3 cm). Soubor pacientů III obsahoval 13 pacientů léčených cetuximabem, přičemž 9 pacientů bylo v progresi onemocnění a 4 pacienti na terapii dobře odpovídali. Vzorky byly sekvenovány na platformě MiSeq. DNA knihovny byly připraveny pomocí kitů SOMATIC 1 MASTER (Multiplicom) a TruSigh Tumor (Illumina). Metodou NGS byl u souboru pacientů I a III analyzován mutační stavu genů mezi primárním tumorem a metastázou. U souboru pacientů II bylo sledováno rozložení variant genů v nádorové populaci v rámci jednoho tumoru. Výsledky ukázaly, že metoda NGS je vhodná pro FFPET vzorky, ale záleží na správné fixaci materiálu. U souboru pacientů II jsme potvrdili stabilní rozložení přítomných mutací genu KRAS napříč nádorovou populací. Vedle toho jsme detekovali s vysokou senzitivitou i minoritní genové varianty. Na souboru pacientů III se ukázalo, jak podstatně se projeví specificita a senzitivita používaných metod v diagnostické praxi. Metoda NGS nám umožnila zachytit mutace v KRAS genu, které dřívějšími metodami nebyli detekovány, ale byly prokazatelnou příčinnou selhání anti-EGFR terapie.

Abstract:

Currently there is a routine investigation of mutational status of genes KRAS and NRAS for patients with metastatic colorectal cancer before the treatement by targeted anti-EGFR therapy. Non-mutational state of RAS gene is the condition for application of anti-EGFR therapy. However, it appears that the testing of one or two markers is not sufficient for the required specification of the patients. The advantage of next generation sequencing is testing of more biomarkers simultaneously, quantification of biomarkers present in the tumor and finally saving of the biological material. The material that was investigated was the DNA from FFPET samples in three groups of patients. Set of patiens I included 5 patients who were tested by mutational state of KRAS gene in my Bachelors thesis. 16 patients were included in the set of patients II. Main criterion was the size of the tumor (3 cm). Set of patients III included 13 patients who were treated by cetuximab, while 9 patiens were in the progression of the disease and 4 patients had good response to the terapy. The samples were sequenced by MiSeq platform. DNA libraries were prepared with help of kits SOMATIC 1 MASTER (Multiplicom) and TruSigh Tumor (Illumina). The mutational state of genes between primary tumor and metastatis among set of patients I and III was analyzed by the NGS method. The distribution of gene variants in the tumor population within a single tumor were monitored in set of patients II. The results has shown that the NGS method is suitable for FFPET samples, but it depends on the proper fixation of the material. We confirmed stable distribution of mutations in KRAS gene accros the cancer population for set of patients II. Besides that we detected with high sensitivity also minor genetic variants. On the set of patients III was shown how much is reflected specificity and sensitivity of diagnostic methods used in practice. The NGS method allowed us to capture mutations in KRAS gene, which were not detected by earlier methods.

Klíčová slova

Kolorektální karcinom, heterogenita nádoru, prediktivní markery, cílená protinádorová léčba, sekvenování nové generace, colorectal cancer, heterogeneity of tumor, predictive markers, targeted antitumor therapy, next generation sequencing

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 18. 5. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 6. 2015
• Vedoucí: Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Genomika a proteomika