Interactions of toxic compounds and Wnt signalling

Mgr. Markéta Kabátková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Receptor pro aromatické uhlovodíky (AhR) je transkripční faktor, který hraje důležitou roli ve vývoji a homeostázi dospělých tkání. Zprostředkovává toxické a karcinogenní účinky mnoha environmentálních polutantů, jako jsou polychlorované dibenzo-p-dioxiny, polychlorované bifenyly nebo polycyklické aromatické uhlovodíky. Ukázalo se, že AhR interaguje s řadou signálních drah. Důležité je, že během posledních 10 let, několik studií naznačilo existenci interakce mezi AhR a Wnt/β-kateninovou signalizací, klíčovým regulátorem embryonálního vývoje a homeostázy v tkáních schopných sebeobnovy. Toto předpokládá, že toxické ligandy AhR by mohly ovlivňovat efektory Wnt signalizace, jako je β-katenin, a tedy měnit aktivitu této dráhy, stejně jako modulovat roli β-kateninu v mezibuněnčné komunikaci, kde zprostředkovává spojení mezi E-kadherinem a sítí aktinových filament. Cílem naší práce bylo zhodnotit interakce AhR a Wnt/β-kateninové signalizace (a příbuzných proteinů) v podmínkách in vitro za použití buněčných modelů užívaných ke studiu toxických a genotoxických účinků AhR ligandů. Předkládané výsledky naznačují, že AhR spolupracuje s Wnt/β-kateninovou signalizační dráhou v jaterních progenitorových buňkách potkana během regulace exprese cílových genů Ah receptoru, jako jsou Cyp1a1 a Cyp1b1, které se podílejí na metabolismu většiny ligandů AhR. Je zajímavé, že trvalá aktivace AhR snižuje hladinu β-kateninu a expresi cílových genů β-kateninu a indukuje přepnutí exprese cytokeratinů, vedoucí ke snížení exprese cytokeratinů 14 a 19, které jsou markery dospělých jaterních kmenových buněk potkana, a zároveň zvýšení exprese cytokeratinu 8, hlavního keratinu v hepatocytech. Společně s β-kateninem, se na tvorbě adherentních spojů podílí γ-katenin (známý také jako plakoglobin). Plakoglobin je hlavní strukturní část desmosomů, kde interaguje s desmosomálními kadheriny, plakofilinem a desmoplakinem, které jsou napojeny na intermediární filamenta. Současně s pozorovaným snížením β-kateninu, aktivace AhR redukovala expresi plakoglobinového genu (Jup) v jaterních progenitorových buňkách potkana. Bylo potvrzeno, že snížení exprese plakoglobinu je závislé na AhR a že tomu tak je i v různých jaterních a srdečních buněčných modelech hlodavců. Naše zjištění týkající se možné úlohy Wnt/β-kateninové signalizace v regulaci CYP1 enzymů, nás vedla k dalšímu zkoumání možné interakce mezi touto dráhou a genotoxickými ligandy AhR v buněčných modelech odvozených od kolonového epitelu. V kolonu se Wnt/β-kateninová signalizace podílí na udržování sebeobnovy buněk a narušení této funkce je spojeno s vývojem nádoru. Benzo[a]pyren (BaP) je toxický ligand AhR a dietární karcinogen, který není přímo mutagenní, ale musí být bioaktivován CYP1 enzymy. V nádorových buňkách kolonu s deregulovanou Wnt/β-kateninovou signalizací, vede potlačení β-kateninu k významnému zvýšení exprese a aktivity CYP1 enzymů, zejména CYP1A1, což způsobuje posílení metabolismu a genotoxicity BaP, projevující se tvorbou stabilních DNA aduktů nebo zlomů řetězců DNA nebo indukcí genů zapojených do odpovědi na poškození DNA. Tyto výsledky znamenají, že β-katenin by mohl mít vice komplexní úlohu v regulaci metabolismu BaP (a podobných karcinogenů), než se dříve předpokládalo, a že tato akce může ovlivňovat poškození DNA způsobené genotoxickými AhR ligandy, nebo příbuznými látkami, jak druhově tak buněčně specifickým způsobem.

Abstract:

The aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a transcription factor that plays an important role in both development and adult tissue homeostasis. It mediates toxic and carcinogenic effects of numerous environmental pollutants, including polychlorinated dibenzo-p-dioxins, polychlorinated biphenyls or polycyclic aromatic hydrocarbons. The AhR has been shown to interact with a number of signalling pathways. Importantly, during the past decade, several studies have indicated existence of a cross-talk between the AhR and the Wnt/β-catenin signalling, a key regulator of embryonic development and homeostatic self-renewal in adult tissues. This suggests that the toxic ligands of the AhR might interfere with effectors of the Wnt signalling, such as -catenin and thus alter activity of the pathway, as well as to modulate its role in cell-to-cell communication, where β-catenin mediates connection of E-cadherin to the actin filament network. The aim of our work was to evaluate interactions of the AhR and the Wnt/β-catenin signalling (and related proteins) in vitro, using cellular models established in studies on toxic and genotoxic effects of the AhR ligands. The present results indicate that the AhR co-operates with the Wnt/β-catenin signalling pathway in rat liver progenitor cells in regulation of expression of the AhR target genes, such as Cyp1a1 and Cyp1b1, which participate in metabolism of most of the AhR ligands. Interestingly, a sustained AhR activation decreases β-catenin levels and expression of β-catenin transcriptional targets, and it induces a switch of cytokeratin expression, leading to down-regulation of both cytokeratins 14 and 19, which are markers of rat adult liver stem cells, simultaneously with up-regulation of cytokeratin 8, a major hepatocyte keratin. Together with β-catenin, γ-catenin (also called plakoglobin) participates in formation of adherens junctions. Plakoglobin is a major structural component of desmosomes, where it interacts with desmosomal cadherins, plakophilin and desmoplakin that are associated with intermediate filaments. Simultaneously with the observed -catenin down-regulation, the activation of the AhR reduces expression of plakoglobin gene (Jup) in rat liver progenitor cells. The down-regulation of plakoglobin has been confirmed to be the AhR-dependent and it occurs in a variety of both liver and cardiac rodent cellular models. Our findings on the potential role of the Wnt/β-catenin signalling in regulation of CYP1 enzymes, have led us to further explore potential interaction between this pathway and genotoxic ligands of the AhR in colon epithelial cell models. In colon, the Wnt/β-catenin signalling is involved in maintenance of cell renewal, and disruption of its function has been linked to tumour development. Benzo[a]pyrene (BaP) is a toxic AhR ligand and dietary carcinogen, which is not directly mutagenic and it needs to be bioactivated via the action of CYP1 enzymes. In colon cancer cells with deregulated Wnt/β-catenin signalling, a suppression of β-catenin led to a marked up-regulation of expression/activity of CYP1 enzymes, in particular CYP1A, thus leading to enhanced BaP metabolism and genotoxicity, manifested as formation of stable DNA adducts, DNA strand breaks or induction of genes involved in DNA damage response. These results imply that -catenin may have a more complex role in regulation of metabolism of BaP (and related carcinogens) than previously suspected, and that its action may modulate DNA damage elicited by genotoxic AhR ligands, or related compounds, in both species- and cell-specific manner.

Keywords

receptor pro aromatické uhlovodíky, benzo[a]pyren, 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-p-dioxin, cytochromy P450 rodiny 1, Wnt/β-kateninová dráha, mezibuněčná komunikace, poškození DNA, aryl hydrocarbon receptor, benzo[a]pyrene, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, cytochromes P450 family 1, Wnt/β-catenin pathway, intercellular communication, DNA damage

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 5. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 12. 6. 2015
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D.
• Reader: prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, CSc., Ing. Július Brtko, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology