Nukleoproteinové komplexy telomer

Mgr. Iva Mozgová, Ph.D.

Doctoral thesis

Nucleoprotein Complexes of Telomeres

Anotácia:

Předkládaná disertační práce se věnuje struktuře a stabilitě tandemových repetic v genomu modelové rostliny Arabidopsis thaliana. První část práce se zabývá popisem vazby domnělého telomer-vazebného proteinu AtTRB1na DNA in vitro (publikace Mozgová et al., 2008). Druhá, rozsáhlejší část práce, je zaměřená na studium stability a udržováni telomer a 45S rDNA za podmínek narušeného sestavování chromatinu (publikace Mozgová et al., 2010 a další nepublikované výsledky). Telomery jsou nukleoproteinové konce chromozomů, které chrání DNA, zabezpečují její úplnou replikaci a zamezují tomu, aby byla koncová DNA nesprávně rozpoznána jako substrát pro procesy opravy DNA a pro rekombinaci. Klasické telomery jsou tvořeny minisatelitními sekvencemi 5´- TTAGGG – 3´ u savců a 5´- TTTAGGG – 3´ u rostlin, které vytvářejí dlouhou dvouřetězcovou (ds) oblast telomer zakončenou jednovláknovým (ss) G-bohatým 3´- přesahem. Telomery savců jsou chráněny hexamerním proteinovým komplexem, zvaným “shelterin”, který se skládá z dsDNA-vazebných proteinů TRF1 a TRF2, ssDNA-vazebného proteinu POT1 a asociovaných proteinů RAP1, TIN2 a TPP1. U rostlin byly identifikovány tři skupiny kandidátních proteinů, označované TRFLI, TRFLII a SMH. SMH protein AtTRB1 je tvořen třemi doménami – “Myb-like”, H1/H5, a “coiled-coil” doménou. Ukázali jsme, že za preferenci AtTRB1 s telomerové dsDNA zodpovídá Myb-like doména, H1/H5 doména zodpovídá za dimerizaci celého proteinu a pravděpodobně se podílí na vazbě AtTRB1 na telomerovou DNA. Sestavování nukleozomů na nově zreplikovaném vláknu DNA je zprostředkováno histonovým chaperonem CAF1 (Chromatin Assembly Factor 1). Výsledky této práce ukázaly, že mutace dvou ze tří podjednotek CAF1 u A. thaliana – FAS1 a FAS2 – vedou ke zkrácení telomer na cca 1/3 standardní délky a ke ztrátě cca 90 % kopií 45S rDNA během 9 generací rostlin. Počet kopií 5S rDNA a centromerických repetic nejsou mutacemi ovlivněny. Mutantní rostliny jsou citlivé k poškození DNA, zejména ke vzniku dvouřetězcových zlomů, což naznačuje narušenou schopnost oprav DNA. Ztráta sekvencí DNA navzdory předpokladům neovlivňuje transkripci 45S rDNA ani telomer. Přestože je možné ztrátu sekvencí částečně zvrátit vnesením standardní alely do G2 mutantní rostliny, shodného efektu nebylo docíleno expresí cDNA v G4 mutantních rostlinách. Přestože práce ukázala řadu zajímavých a neočekávaných výsledků a přestože snahou bylo pozorované jevy vysvětlit, mechanismy ztráty telomer a 45S rDNA u rostlin mutantních v podjednotkách komplexu CAF1 zůstávají nejasné.

Abstract:

The presented thesis deals with the chromatin structure and maintenance of major tandem repeats in the model plant Arabidopsis thaliana. The first part focuses on the description of in vitro binding of a putative telomere-binding protein AtTRB1 to DNA (published in Mozgova et al., 2008). The second and major part deals with the question of how can distorted chromatin assembly affect the stability and maintenance of telomeres and 45S rDNA (Mozgova et al., 2010; unpublished results). Telomeres form the chromosome ends and serve to protect the DNA, ensure its complete replication, and to prevent incorrect recognition of the chromosome end as a substrate for DNA repair and recombination. Typically, the minisatellite sequences 5´- TTAGGG – 3´ in mammals and 5´- TTTAGGG – 3´ in plants form the telomeric double-stranded (ds) DNA which is terminated by a single-stranded (ss) G-rich 3´-overhang. The mammalian telomere is safeguarded by a hexameric protein complex called “shelterin”, composed of dsDNA-binding proteins TRF1 and TRF2, ssDNA-binding protein POT1 and associated proteins RAP1, TIN2 and TPP1. Three separate families of proteins are suggested to bind the plant telomeric dsDNA - TRFLI, TRFLII and SMH. Here, I focus on the SMH family protein AtTRB1, composed of three functional domains – the Myb-like domain, the histone-like H1/H5 domain and the coiled-coil domain. We show that the preference of AtTRB1 for ds telomeric DNA is mediated by the Myb-like domain, while the H1/H5 domain may enhance the binding of AtTRB1 to telomeric DNA and play role in the protein dimerization. Replication-dependent nucleosome assembly is mediated by Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1), an evolutionarily conserved three subunit histone H3/H4 chaperone. We show here that mutations in two A. thaliana CAF1 subunits – FAS1 and FAS2 – lead to progressive telomere shortening to ca 1/3 of the wild-type length and loss of ca 90 % of the wild-type 45S rDNA copies over 9 plant generations. 5S rDNA and centromeres are stable, suggesting unaffected maintenance. The mutant plants are highly sensitive to DNA damage, indicative of inadequate or impaired DNA repair. Despite the DNA loss, transcription of 45S rDNA or telomeres is unchanged. The sequence loss is partly reverted by the introduction of wild-type allele into G2 mutant background, but not so by the expression of cDNA in G4 mutant background. Although an interesting phenomenon has been observed and attempts were made to explain the effect, the discussed mechanisms leading to the loss of telomeres and 45S rDNA in the CAF1 mutants remain enigmatic.

Keywords

CZ, Arabidopsis thaliana, telomera, rDNA, AtTRB1, CAF1 EN, telomere, CAF1

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 1. 7. 2011
• Vedúci: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
• Oponent: Mgr. Radmila Čapková Frydrychová, Ph.D., RNDr. Karel J. Angelis, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology