In vivo a in vitro analýza enzymatické aktivity sestřihových isoforem lidské demetylázy RNA

Bc. Linda Kašiarová

Master's thesis

In vivo and in vitro analysis of enzymatic activities of alternative isoforms of a human RNA demethylase

Abstract:

Objev FTO demetylázy zavedl koncept reverzibilních modifikací RNA. Uvádí se, že FTO přednostně demetyluje nejhojnější vnitřní modifikaci mRNA u eukaryot – N6-methyladenosin (m6A). m6A hraje důležitou roli v mnoha procesech jak na úrovni buněk, tak na úrovni organismu. Předkládaná práce se zaměřuje na podrobné studium FTO, konkrétně jeho isoforem, které by mohly potenciálně vést ke změně aktivity, substrátové specifity nebo funkce in vivo. Teoretická část poskytuje přehled současných znalostí o mechanismu FTO a jeho roli v biologii savčích buněk. Druhá část je věnována CRISPR/Cas9, biotechnologickému nástroji, který byl použit v experimentální části práce k přípravě lidských FTO knock-out (KO) buněk. Díky knock-outu FTO v buňkách, jsme byli schopni podrobněji prozkoumat účinek různých isoforem FTO v alternativním sestřihu pre-mRNA. Paralelně jsme připravili konstrukty dvou vybraných isoforem FTO pro expresi v lidských a bakteriálních buňkách. Exprese v bakteriálních buňkách a purifikace byly optimalizovány pro tři isoformy FTO. Materiál a výsledky této práce mohou z dlouhodobého hlediska vést k biotechnologickému využití pro odstranění metylačních značek na RNA in vitro a in vivo pomocí FTO demetylázy.

Abstract:

FTO demethylase discovery established the concept of reversible RNA modifications. It has been reported to preferentially demethylate the most abundant internal mRNA modification in eukaryotes – N6-methyladenosine (m6A). m6A plays an important role in many processes at both cellular and organism levels. The presented work focuses on a detailed study of FTO, specifically on its isoforms that could potentially lead to altered activity, substrate specificity, and in vivo function. The theoretical part provides an overview of the current knowledge of the FTO mechanism and its role in the biology of mammalian cells. The second part is dedicated to CRISPR/Cas9 a powerful biotechnological tool that has been used in the experimental part of the thesis to prepare human FTO knock out (KO) cells. Thanks to the FTO KO cells, we were able to investigate in greater detail the effect of different FTO isoforms in alternative pre-mRNA splicing. In parallel, we have prepared constructs of two selected FTO isoforms for expression in human and bacterial cells. Expression in bacterial cells and purification were optimized for three isoforms of FTO. In the long term, the material and results of this work may lead to the biotechnological use of FTO-mediated removal of methylation tags on RNA in vitro and in vivo.

Keywords

FTO, demethylace, m6A, CRISPR/Cas9, alternativní sestřih, demethylation, alternative splicing

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2022
• Supervisor: prof. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.
• Reader: Ing. RNDr. Martin Marek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biotechnology / Biotechnology